Ingeniería del tejido epitelio pigmentario de la retina trasplante adecuado derivado de células madre embrionarias humanas
Summary
Se describe un método para diseñar un retineano tejido compuesto de células epiteliales del pigmento retiniano derivadas de las células de vástago pluripotent humanas cultivadas sobre las membranas amnióticas humanas y su preparación para injerto en modelos animales.
Abstract
Varias condiciones patológicas del ojo afectan a la funcionalidad y la supervivencia del epitelio retiniano del pigmento (RPE). Estas son algunas formas de retinitis pigmentosa (RP) y degeneración macular senil (DMS). La terapia celular es una de las estrategias terapéuticas más prometedoras propuestas para curar estas enfermedades, con alentar ya resultados preliminares en seres humanos. Sin embargo, el método de preparación del injerto tiene un impacto significativo en sus resultados funcionales in vivo. De hecho, son menos funcionales que las misma células trasplantadas como un tejido retiniano células RPE injertadas como una suspensión. Adjunto, describimos un método simple y reproducible al ingeniero RPE tejido y su preparación para la implantación de una en vivo . Se siembran las células RPE derivadas de células madre pluripotentes humanas sobre un soporte biológico, la membrana amniótica humana (jamón). En comparación con andamios artificiales, este apoyo tiene la ventaja de tener una membrana del sótano que está cerca de donde se unen las células RPE endógenas la membrana de Bruch. Sin embargo, su manipulación no es fácil, y hemos desarrollado varias estrategias para su adecuado cultivo y preparación para injerto en vivo.
Introduction
RPE es crucial para la supervivencia y la homeostasis de los fotorreceptores con el cual está firmemente asociado1. Varias condiciones patológicas alteran su funcionalidad y supervivencia, incluyendo RP y AMD.
RP es un grupo de mutaciones monogénicas hereditarias que afectan a las funciones de los fotorreceptores o las células RPE o ambos2,3. Se estima que las mutaciones que afectan específicamente el RPE células representan el 5% de RP2. AMD es otra condición donde se altera la capa RPE, pérdida de visión central en última instancia a líder. AMD es causado por las interacciones complejas de factores genéticos y ambientales y afecta a los ancianos4,5,6. Según las proyecciones, AMD será un motivo de preocupación para pacientes 196 millones en todo el mundo por 20207. Para estos trastornos, no hay cura efectiva existe, y una de las estrategias propuestas es el trasplante de nuevas células RPE para compensar muerto/no funcional preexistente de las células RPE8.
El modo de formulación de los productos finales a ser injertada es esencial para asegurar los mejores resultados funcionales. Células RPE inyectadas como una suspensión, a pesar de ser un método fácil y sencillo de entrega, plantear inquietudes acerca de su supervivencia, integración y funcionalidad9,10,11,12 , 13. los científicos están preparando más formulaciones complejas para ofrecer ingeniería de tejido retiniano9,13,14,15,16. En este contexto, hemos desarrollado un método original para generar el en vitro RPE tejido que podría ser utilizado para trasplante9.
Los bancos de células RPE derivados de células madre embrionarias humanas (ES) se utilizan en el presente Protocolo. Sin embargo, la alternativa RPE célula bancos procedentes de diferentes células (células madre pluripotentes humanas, las células RPE primarias, etc.) y distinguido con un método diferente también son adecuados para este protocolo. Incluye diferenciación dirigida protocolos con citoquinas y moléculas pequeñas17,18,19,20,21,22.
Para ser trasplantado, el tejido diseñado debe estar preparado en un andamio. En los últimos años, diferentes andamios han desarrollado basado en un polímero o en una matriz de origen biológico13,23,24. Aquí, el sustrato biológico utilizado es el jamón, pero otros substratos, como membranas de Bruch denudadas, podrían ser implementados. El método descrito en el presente documento tiene la ventaja de usar un andamio biológico más relevante para el entorno nativo de RPE.
Células madre derivadas de células RPE embrionarias humanas se cultivan durante al menos 4 semanas para completamente organizado como una monocapa de adoquines. En ese momento, el epitelio obtenido es funcional y polarizado9. Por último, como este tejido se arruga fácilmente, está incrustada en una capa delgada de un portador de hidrogel para darle más rigidez y elasticidad y para protegerlo durante el procedimiento de inyección. Este producto se almacena a 4 ° C hasta el injerto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos descrito un método para el cultivo de células RPE sobre un andamio biológico y su preparación para su implantación en modelos animales. Uno de los pasos críticos del protocolo es el mantenimiento de la orientación de la pieza a lo largo del procedimiento hasta su inclusión en gelatina. De hecho, se elimina el epitelio nativo de la membrana y su membrana basal se convierte expuestos9. Las células RPE deban ser sembrado en la cima de esta membrana del sótano. En preparación para inc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Jérôme Larghero y Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, París, Francia) por su aporte durante la puesta en marcha del método descrito aquí.
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la ANR [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], la Fundación pour la Recherche Médicale [programa de Bio-ingeniería – DBS20140930777] y de la empresa LABEX revivir [ANR-10-LABX-73] Olivier Goureau y Christelle Monville. Fue apoyado por NeurATRIS, una infraestructura de investigación traslacional (Investissements Avenir) para bioterapias en Neurociencias [ANR-11-INBS-0011] y INGESTEM, la infraestructura nacional (Investissements Avenir) Ingeniería pluripotentes y diferenciadas las células madre [ANR-11-INBS-000] Christelle Monville. Karim Ben M’Barek fue apoyado por becas de DIM Stempole y la empresa LABEX revivir [ANR-10-LABX-73]. Madre es parte del Instituto de bioterapias para enfermedades raras, apoyados por la Association Française contre les Myopathies (AFM)-Téléthon.
Materials
| Sterile biosafety cabinet | TechGen International | Not applicable | |
| Liquid waste disposal system for aspiration | Vacuubrand | BVC 21 | |
| CO2-controlled +37 °C cell incubator | Thermo Electron Corporation | BVC 21 NT | |
| 200 µL pipette: P200 | Gilson | F144565 | |
| 1 mL pipette: P1000 | Gilson | F144566 | |
| Pipet aid | Drummond | 75001 | |
| +4 °C refrigerator | Liebherr | Not applicable | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fine scissors | WPI | 501758 | |
| Forceps (x2) | WPI | 555227F | |
| Water bath | Grant subaqua pro | SUB6 | |
| Precision balance | Sartorius | CP225D | |
| Centrifuge | Eppendorff | 5804 | |
| Microscope | Olympus | SC30 | |
| Horizontal Rocking Shaker | IKA-WERKE | IKA MTS 214D | |
| Vortex | VWR | LAB DANCER S40 | |
| Disposable Scalpel | WPI | 500351 | |
| plastic paraffin film | VWR | PM992 | |
| 0.200 µm single use syringe filter | SARTORIUS | 16532 | |
| Syringe without needle 50 mL | Dutscher | 50012 | |
| Bottles 250mL | Dutscher | 28024 | |
| 15 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352097 | |
| 50 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352098 | |
| culture insert | Scaffdex | C00001N | |
| 60 mm cell culture disches: B6 | Dutscher | 353004 | |
| 12 well cell culture plate | Corning | 3512 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3506 | |
| Razor blades | Ted Pella, Inc | 121-9 | |
| Cyanoacrylate glue | Castorama | 3178040670105 | |
| PBS 1X (500 mL) | Sigma | D8537 | |
| Thermolysine | Roche | 5339880001 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965-026 | |
| KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) | Invitrogen | 12618-013 | |
| MEM-NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-035 | |
| b-mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| CO2-independent medium | GIBCO | 18045-054 | |
| Gelatin | MERCK | 104078 | |
| human amniotic membrane | Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) | Not applicable |
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