Инженерные трансплантации подходит сетчатки пигментного эпителия ткани, полученных из человеческих эмбриональных стволовых клеток
Summary
Мы описываем метод инженер ткани сетчатки, состоящий из эпителиальных клеток сетчатки пигмент, производный от человеческих плюрипотентных стволовых клеток, культивируемых на вершине человека амниотической мембраны и подготовки ее к прививке в животных моделях.
Abstract
Ряд патологических состояний глаз влияет на функциональность и/или выживание пигментный эпителий сетчатки (ПЭС). К ним относятся некоторые формы пигментный ретинит (RP) и возрастной макулярной дегенерации (AMD). Клеточная терапия является одним из наиболее перспективных терапевтических стратегий, предложенных для лечения этих заболеваний, с уже обнадеживающие предварительные результаты в организме человека. Однако метод подготовки трансплантат имеет значительное влияние на его функциональных результатов в естественных условиях. Действительно НПП клетки, привитые как суспензию клеток менее функциональной, чем те же клетки, пересаженные в ткани сетчатки. Здесь мы опишем простой и воспроизводимый метод инженер НПП ткани и ее подготовка к имплантации в естественных условиях . НПП клетки, полученные из человеческих плюрипотентных стволовых клеток являются семенами на биологических поддержки, человека амниотической мембраны (Хам). По сравнению с искусственных лесов, эта поддержка имеет преимущество базальной мембраны, что близко к мембраны Бруха, где прилагаются эндогенного НПП клетки. Однако его манипуляции не легко, и мы разработали ряд стратегий для ее надлежащего культивирования и подготовки для прививки в естественных условиях.
Introduction
НПП имеет решающее значение для выживания и гомеостаза фоторецепторов, с которыми это тесно связанные1. Ряд патологических состояний изменить его функциональность и/или выживание, включая RP и AMD.
RP — это группа унаследованных Моногенные мутаций, которые влияют на функции фоторецепторов или НПП клетки или оба2,3. Предполагается, что мутации, которые влияют на специально НПП клетки приходится 5% RP2. AMD является еще одним условием, где изменяется уровень ПЭС, ведущих в конечном итоге на центральное зрение потери. AMD обусловлено сложных взаимодействий генетических и экологических факторов и затрагивает пожилых4,5,6. Согласно прогнозам AMD будет проблемой для 196 миллионов пациентов во всем мире к 2020 году7. Для этих расстройств Существует нет эффективного лечения, и одна из предлагаемых стратегий является трансплантация новых НПП клеток для того чтобы компенсировать мертвых/нефункциональных существовавшие ранее НПП клетки8.
Режим разработки окончательного продукта, чтобы быть привиты имеет важное значение для обеспечения лучших функциональных результатов. НПП клетки вводят в виде суспензии клеток, несмотря на легкий и простой метод доставки, вызывают озабоченность по поводу их выживания, интеграции и функциональность9,10,11,12 , 13. ученые в настоящее время разрабатывают более сложных составов для доставки инженерии тканей сетчатки9,13,14,,1516. В этом контексте мы разработали оригинальный метод для создания в vitro НПП ткани, которые могут быть использованы для трансплантации9.
Банки НПП клеток, полученные из клеток человеческих эмбриональных стволовых (ES) используются в настоящем Протоколе. Однако альтернативные НПП мобильных банков из источников различных клеток (человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, первичный НПП клетки и т.д.) и продифференцировано с другой метод, также пригодны для этого протокола. Она включает в себя направленного дифференцирования протоколов с помощью цитокинов и/или малых молекул,1718,19,20,21,22.
Чтобы быть трансплантированы, инженерии ткани должен быть подготовлен на леске. В последние несколько лет различные строительные леса были разработаны на основе полимера или на матрицу биологического происхождения13,,23–24. Здесь биологического субстрата используется ветчина, но других субстратов, как оголенные мембраны Бруха, могут быть реализованы. Метод, описанный здесь имеет преимущество использования биологических эшафот, что более актуально для родной среде ПЭС.
Человеческие клетки ES клеток ПЭС культивированный для по крайней мере 4 недель для того, чтобы быть полностью организованы как булыжник монослоя. На этом этапе эпителии полученных функциональных и поляризованных9. Наконец как эта ткань морщины легко, он внедрен в тонком слое гидрогеля перевозчика дать ему больше жесткости и упругости и защитить его во время процедуры инъекции. Затем этот продукт хранится при температуре 4 ° C до прививки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описали метод для культуры клеток ПЭС на биологические леску и его подготовка к имплантации в животных моделях. Одним из важнейших шагов протокола является поддержание ориентации Хэм вдоль всей процедуры до его включения в желатин. Действительно родной эпителия мембрану удаляется …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Жером Larghero и Валери Vanneaux (Hôpital Сент-Луис, Париж, Франция) за их вклад в создание метода, описанного здесь.
Эта работа была поддержана от грантов от НРУ [GPiPS: АНР-2010-RFCS005; SightREPAIR: АНР-16-CE17-008-02], Фонд pour la Recherche сообщала [Программа инженерно био – DBS20140930777] и от LABEX ОЖИВИТЬ [АНР-10-LABX-73] Оливье Goureau и Кристель Монвиля. Оно было поддержано NeurATRIS, поступательные исследовательской инфраструктуры (будущее Investissements) для biotherapies в неврологии [АНР-11-INBS-0011] и INGESTEM, национальной инфраструктуры (будущее Investissements) техника для плюрипотентных и дифференцированные стволовые клетки [АНР-11-INBS-000] Кристель Монвиля. Карим Бен Мбарек была поддержана стипендии от DIM Stempole и LABEX ОЖИВИТЬ [АНР-10-LABX-73]. Стволовых является частью Biotherapies института для редких заболеваний, поддержке французской ассоциации contre les миопатии (AFM)-Téléthon.
Materials
| Sterile biosafety cabinet | TechGen International | Not applicable | |
| Liquid waste disposal system for aspiration | Vacuubrand | BVC 21 | |
| CO2-controlled +37 °C cell incubator | Thermo Electron Corporation | BVC 21 NT | |
| 200 µL pipette: P200 | Gilson | F144565 | |
| 1 mL pipette: P1000 | Gilson | F144566 | |
| Pipet aid | Drummond | 75001 | |
| +4 °C refrigerator | Liebherr | Not applicable | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fine scissors | WPI | 501758 | |
| Forceps (x2) | WPI | 555227F | |
| Water bath | Grant subaqua pro | SUB6 | |
| Precision balance | Sartorius | CP225D | |
| Centrifuge | Eppendorff | 5804 | |
| Microscope | Olympus | SC30 | |
| Horizontal Rocking Shaker | IKA-WERKE | IKA MTS 214D | |
| Vortex | VWR | LAB DANCER S40 | |
| Disposable Scalpel | WPI | 500351 | |
| plastic paraffin film | VWR | PM992 | |
| 0.200 µm single use syringe filter | SARTORIUS | 16532 | |
| Syringe without needle 50 mL | Dutscher | 50012 | |
| Bottles 250mL | Dutscher | 28024 | |
| 15 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352097 | |
| 50 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352098 | |
| culture insert | Scaffdex | C00001N | |
| 60 mm cell culture disches: B6 | Dutscher | 353004 | |
| 12 well cell culture plate | Corning | 3512 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3506 | |
| Razor blades | Ted Pella, Inc | 121-9 | |
| Cyanoacrylate glue | Castorama | 3178040670105 | |
| PBS 1X (500 mL) | Sigma | D8537 | |
| Thermolysine | Roche | 5339880001 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965-026 | |
| KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) | Invitrogen | 12618-013 | |
| MEM-NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-035 | |
| b-mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| CO2-independent medium | GIBCO | 18045-054 | |
| Gelatin | MERCK | 104078 | |
| human amniotic membrane | Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) | Not applicable |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Gehrs, K. M., Anderson, D. H., Johnson, L. V., Hageman, G. S. Age-related macular degeneration–emerging pathogenetic and therapeutic concepts. Annals of Medicine. 38 (7), 450-471 (2006).
- Swaroop, A., Chew, E. Y., Rickman, C. B., Abecasis, G. R. Unraveling a multifactorial late-onset disease: from genetic susceptibility to disease mechanisms for age-related macular degeneration. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 19-43 (2009).
- Khandhadia, S., Cherry, J., Lotery, A. J. Age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 724, 15-36 (2012).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ben M’Barek, K., Regent, F., Monville, C. Use of human pluripotent stem cells to study and treat retinopathies. World Journal of Stem Cells. 7 (3), 596-604 (2015).
- Ben M’Barek, K., et al. Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt’s macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Hsiung, J., Zhu, D., Hinton, D. R. Polarized human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cell monolayers have higher resistance to oxidative stress-induced cell death than nonpolarized cultures. Stem Cells Translational Medicine. 4 (1), 10-20 (2015).
- Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (7), 5087-5096 (2013).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Thomas, B. B., et al. Survival and functionality of hESC-derived retinal pigment epithelium cells cultured as a monolayer on polymer substrates transplanted in RCS rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (6), 2877-2887 (2016).
- Borooah, S., et al. Using human induced pluripotent stem cells to treat retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 37, 163-181 (2013).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise review: Making stem cells retinal: Methods for deriving retinal pigment epithelium and implications for patients with ocular disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells as a tool to model a form of Leber congenital amaurosis. Cellular Reprogramming. 15 (3), 233-246 (2013).
- Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS Cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
- Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10950-10955 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Ilmarinen, T., et al. Ultrathin polyimide membrane as cell carrier for subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium. PloS One. 10 (11), e0143669 (2015).
- Thumann, G., Schraermeyer, U., Bartz-Schmidt, K. U., Heimann, K. Descemet’s membrane as membranous support in RPE/IPE transplantation. Current Eye Research. 16 (12), 1236-1238 (1997).
- Kiilgaard, J. F., Scherfig, E., Prause, J. U., la Cour, M. Transplantation of amniotic membrane to the subretinal space in pigs. Stem Cells International. 2012, 716968 (2012).
- Capeans, C., et al. Amniotic membrane as support for human retinal pigment epithelium (RPE) cell growth. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (3), 271-277 (2003).
- Ohno-Matsui, K., et al. The effects of amniotic membrane on retinal pigment epithelial cell differentiation. Molecular Vision. 11, 1-10 (2005).
- Paolin, A., et al. Amniotic membranes in ophthalmology: long term data on transplantation outcomes. Cell and Tissue Banking. 17 (1), 51-58 (2016).
- Hu, Y., et al. A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer. Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).
- Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent stem cell-based therapies in combination with substrate for the treatment of age-related macular degeneration. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: The Official Journal of the Association. 32 (5), 261-271 (2016).
- Song, M. J., Bharti, K. Looking into the future: Using induced pluripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling. Brain Research. 1638 (Pt A), 2-14 (2016).
- Ramsden, C. M., et al. Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future). Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
- Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
- Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Transplantation of the RPE in AMD. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (5), 516-554 (2007).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
