Engenharia de tecido de epitélio do pigmento da retina transplante-apropriado derivado de células estaminais embrionárias humanas
Summary
Nós descrevemos um método para engenheiro um retina tecido composto de células epiteliais de pigmento retinal derivadas de células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em cima de membrana amniótica humana e sua preparação para enxertia em modelos animais.
Abstract
Diversas condições patológicas do olho afetam a funcionalidade e/ou a sobrevivência do epithelium retinal do pigment (RPE). Estes incluem algumas formas de retinite pigmentosa (RP) e degeneração macular relacionada à idade (DMRI). Terapia celular é uma das estratégias mais promissoras terapêuticas propostas para curar estas doenças, com já incentivando os resultados preliminares em seres humanos. No entanto, o método de preparação do enxerto tem um impacto significativo em seus resultados funcionais em vivo. Com efeito, as células RPE enxertadas como uma suspensão de células são menos funcionais do que as mesmas células transplantadas como um tecido da retina. Aqui, descrevemos um método simples e reprodutível para engenheiro RPE tecido e sua preparação para a implantação na vivo . As células RPE derivadas de células-tronco pluripotentes humanas são semeadas sobre um suporte biológico, a membrana amniótica humana (presunto). Comparado aos andaimes artificiais, este apoio tem a vantagem de ter uma membrana basal que é perto da membrana de Bruch, onde as células RPE endógenas estão conectadas. No entanto, sua manipulação não é fácil, e desenvolvemos várias estratégias para seu cultivo adequado e preparação para enxertia em vivo.
Introduction
RPE é crucial para a sobrevivência e a homeostase dos FOTORRECEPTORES com o qual é fortemente associado1. Diversas condições patológicas alteram a sua funcionalidade e/ou sobrevivência, incluindo RP e AMD.
RP é um grupo de mutações herdadas de monogénicas que afetam as funções de fotorreceptores, células RPE ou ambos os2,3. Estima-se que as mutações que afetam especificamente o RPE células conta para 5% da RP2. AMD é outra condição onde a camada RPE é alterada, perda de visão, em última análise, a central principal. AMD é causada pelas complexas interações de fatores genéticos e ambientais e afeta os idosos4,5,6. De acordo com projeções, a AMD vai ser uma preocupação para os pacientes 196 milhões em todo o mundo por 20207. Para estes distúrbios, não existe nenhuma cura eficaz e uma das estratégias propostas é o transplante de células RPE novos para compensar mortos/não-funcionais preexistente RPE células8.
O modo de formulação do produto final a ser enxertado é essencial para garantir os melhores resultados funcionais. As células RPE injetadas como uma suspensão de células, apesar de ser um método fácil e simples de entrega, aumentar as preocupações em relação a sua sobrevivência, integração e funcionalidade9,10,11,12 , 13. cientistas desenvolvem-se mais complexas formulações para entregar engenharia tecido retinal9,13,14,15,16. Neste contexto, desenvolvemos um método original para gerar em vitro tecido RPE que poderia ser usado para transplante9.
Os bancos de células RPE derivados de células-tronco embrionárias humanas (ES) são usados no presente protocolo. No entanto, a alternativa RPE celular bancos de fontes diferentes células (células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem, as células RPE primárias, etc.) e diferenciados com um método diferente também são adequados para este protocolo. Diferenciação dirigida inclui protocolos usando citocinas e/ou pequenas moléculas17,18,19,20,21,22.
Para ser transplantado, o tecido projetado deve ser preparado em um andaime. Nos últimos anos, andaimes diferentes foram desenvolvidos com base em um polímero ou em uma matriz de origem biológica13,23,24. Aqui, o substrato biológico utilizado é o presunto, mas outros substratos, como membranas de Bruch desnudas, poderiam ser implementados. O método aqui descrito tem a vantagem de usar um andaime biológico que é mais relevante para o ambiente nativo de RPE.
ES derivado de células RPE as células humanas são cultivadas pelo menos 4 semanas para ser totalmente organizado como uma monocamada de paralelepípedos. Nessa fase, o epitélio obtido é funcional e polarizada9. Finalmente, como este tecido enruga facilmente, ele é incorporado em uma camada fina de uma operadora de hidrogel para dar mais rigidez e elasticidade e para protegê-lo durante o procedimento de injeção. Este produto é então armazenado em 4 ° C até enxertia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós descrevemos um método para a cultura de células RPE sobre um andaime biológico e sua preparação para implantação em modelos animais. Uma das etapas críticas do protocolo é a manutenção da orientação do presunto por todo o procedimento até sua inclusão em gelatina. Com efeito, é removido o epitélio nativo da membrana e sua membrana basal torna-se exposto9. As células RPE possuem ser semeado em cima desta membrana basal. Após a preparação para a incorporação de gelatina, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer Jérôme Larghero e Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, Paris, França) para a sua entrada durante a instauração do método descrito aqui.
Este trabalho foi apoiado por concessões do ANR [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], o Fondation pour la Recherche Médicale [programa de Bio-Engenharia – DBS20140930777] e do LABEX REVIVE [ANR-10-LABX-73] Olivier Goureau e Christelle Monville. Era apoiado por NeurATRIS, uma infra-estrutura de pesquisa translacional (Investissements d’Avenir) para biotherapies em Neurociências [ANR-11-INBS-0011] e INGESTEM, a infra-estrutura nacional (Investissements d’Avenir) engenharia para pluripotentes e células-tronco diferenciadas [ANR-11-INBS-000] para Christelle Monville. Karim Ben M’Barek foi apoiado por bolsas de Stempole DIM e LABEX REVIVE [ANR-10-LABX-73]. -Tronco faz parte do Instituto de doenças raras, apoiada pela Association Française contre les miopatias (AFM) Biotherapies-Téléton.
Materials
| Sterile biosafety cabinet | TechGen International | Not applicable | |
| Liquid waste disposal system for aspiration | Vacuubrand | BVC 21 | |
| CO2-controlled +37 °C cell incubator | Thermo Electron Corporation | BVC 21 NT | |
| 200 µL pipette: P200 | Gilson | F144565 | |
| 1 mL pipette: P1000 | Gilson | F144566 | |
| Pipet aid | Drummond | 75001 | |
| +4 °C refrigerator | Liebherr | Not applicable | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fine scissors | WPI | 501758 | |
| Forceps (x2) | WPI | 555227F | |
| Water bath | Grant subaqua pro | SUB6 | |
| Precision balance | Sartorius | CP225D | |
| Centrifuge | Eppendorff | 5804 | |
| Microscope | Olympus | SC30 | |
| Horizontal Rocking Shaker | IKA-WERKE | IKA MTS 214D | |
| Vortex | VWR | LAB DANCER S40 | |
| Disposable Scalpel | WPI | 500351 | |
| plastic paraffin film | VWR | PM992 | |
| 0.200 µm single use syringe filter | SARTORIUS | 16532 | |
| Syringe without needle 50 mL | Dutscher | 50012 | |
| Bottles 250mL | Dutscher | 28024 | |
| 15 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352097 | |
| 50 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352098 | |
| culture insert | Scaffdex | C00001N | |
| 60 mm cell culture disches: B6 | Dutscher | 353004 | |
| 12 well cell culture plate | Corning | 3512 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3506 | |
| Razor blades | Ted Pella, Inc | 121-9 | |
| Cyanoacrylate glue | Castorama | 3178040670105 | |
| PBS 1X (500 mL) | Sigma | D8537 | |
| Thermolysine | Roche | 5339880001 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965-026 | |
| KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) | Invitrogen | 12618-013 | |
| MEM-NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-035 | |
| b-mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| CO2-independent medium | GIBCO | 18045-054 | |
| Gelatin | MERCK | 104078 | |
| human amniotic membrane | Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) | Not applicable |
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