הנדסת רקמות אפיתל הפיגמנט ברשתית השתלת-מתאים נגזר תאי גזע עובריים
Summary
אנו מתארים שיטה להנדס רקמת רשתית מורכב של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע pluripotent אנושית ותרבותית על גבי קרום מי השפיר האנושי והכנה שלו הרכבה במודלים של בעלי חיים.
Abstract
מספר מצבים פתולוגיים של העין משפיע על הפונקציונליות ו/או ההישרדות של אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE). אלה כוללים כמה צורות של רטיניטיס פיגמנטוזה (RP), הקשורות לגיל ניוון מקולרי (AMD). טיפול בתאי הוא אחד אסטרטגיות טיפוליות המבטיחים ביותר המוצע כדי לרפא מחלות אלו, עם עידוד כבר תוצאות ראשוניות בבני אדם. עם זאת, שיטת ההכנה של השתל יש השפעה משמעותית על תוצאות תפקודי שלה בתוך vivo. אכן, תאי RPE הושתל כמו השעיה תא מתפקדים פחות מאשר אותם התאים המושתלים כמו רקמת רשתית. במסמך זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לשחזור מהנדס RPE רקמות, שלה לקראת ההשתלה ויוו . תאי RPE שמקורם בתאי גזע pluripotent האנושי הם נזרע על תמיכה ביולוגית, קרום מי השפיר אנושי (חזיר). לעומת פיגומים מלאכותי, תמיכה זו יש את היתרון של בעל קרום המרתף קרוב הממברנה של ברוך שבו תאי RPE אנדוגני מצורפות. עם זאת, מניפולציה שלה אינה קלה, פיתחנו מספר אסטרטגיות שלה culturing הנכונה והכנה הרכבה בתוך vivo.
Introduction
RPE חיונית הישרדות, הומאוסטזיס של photoreceptors אליו היא משויכת באופן הדוק1. מספר מצבים פתולוגיים לשנות פונקציונליות שלה ו/או הישרדות, כולל RP ו- AMD.
RP היא קבוצה של מוטציות monogenic בירושה המשפיעות על הפונקציות של photoreceptors או תאי RPE או שני2,3. ההערכה היא כי מוטציות המשפיעות באופן ספציפי את RPE תאים חשבון עבור 5% של RP2. AMD היא תנאי אחר שבו השכבה RPE היא שונה, אובדן ראייה בסופו של דבר מרכזי מוביל. AMD נגרמת על ידי פעולת הגומלין המורכבים בין גורמים גנטיים וסביבתיים, ומשפיעה על קשישים4,5,6. על פי התחזיות, AMD יהיה נוגע 196 מיליון חולים ברחבי העולם על ידי 20207. בהפרעות אלה, אין תרופה יעילה קיימת, באחת האסטרטגיות הציע השתלת תאי RPE חדשים כדי לפצות על המלח/מתפקד שישנו RPE תאים8.
המצב של ניסוח של המוצר הסופי כדי להיות הושתל חיונית כדי להבטיח את התוצאה הטובה ביותר תפקודית. תאי RPE להזריק לפי השעיה תא, למרות היותו שיטה קלה וישירה של משלוח, להעלות חששות לגבי שלהם הישרדות, אינטגרציה, פונקציונליות9,10,11,12 , 13. מדענים מפתחים יותר כעת ניסוחים מורכבים כדי לספק מהונדסים רקמת רשתית9,13,14,15,16. בהקשר זה, פיתחנו שיטה מקורית ליצירת במבחנה רקמות RPE שיכול לשמש עבור השתלת9.
בנקים תאי RPE שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים (ES) נמצאים בשימוש בפרוטוקול זה. עם זאת, חלופה RPE תא בנקים ממקורות שונים תא (תאי גזע pluripotent הנוצרות על-ידי האדם, תאי RPE העיקרי, וכו ‘) ו הבדיל בשיטה שונה מתאימים גם עבור פרוטוקול זה. היא כוללת התמיינות מכוונת פרוטוקולים בעזרת ציטוקינים ו/או מולקולות קטנות17,18,19,20,21,22.
כדי להיות מושתלים, להכין את רקמות מהונדסים על גרדום. בשנים האחרונות, פיגומים שונים פותחו בהתבסס על פולימר או על מטריצה של מקור ביולוגי13,23,24. כאן, המצע הביולוגי משמש החזיר, אבל מצעים אחרים, כמו ממברנות ברוך חשופה, ניתן ליישום. השיטה המתוארת במסמך זה יש את היתרון של שימוש לפיגום הביולוגי שהוא רלוונטי יותר לסביבה הטבעית RPE.
ES האדם הנגזרות תא תאי RPE מתורבתים לפחות 4 שבועות על מנת להיות מאורגן באופן מלא כמו טפט המרוצף. בשלב זה, האפיתל שהושג הוא פונקציונלי, מקוטב9. לבסוף, ככל רקמה זו מתקמט בקלות, זה מוטבע בשכבה דקה של נשאית הידרוג לתת לזה עוד קשיחות ואלסטיות וכדי להגן עליו במהלך ההליך הזרקה. מוצר זה מאוחסן אז ב 4 ° C עד הרכבה.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנחנו תיאר שיטה התרבות של תאי RPE וביום לפיגום הביולוגי שלה לקראת ההשתלה במודלים של בעלי חיים. אחד השלבים הקריטיים של הפרוטוקול הוא שמירה על הכיוון של הבשר לאורך כל ההליך עד ההכללה שלו לתוך הג’לטין. אכן, האפיתל מקורית של הקרום יוסר ולא קרום המרתף שלו הופך להיות חשוף9. תאי RPE חייב ל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות ג’רום Larghero, ואלרי Vanneaux (Hôpital סנט לואיס, פריז, צרפת) לקבל את התשומה שלהם במהלך את ההגדרה של השיטה המתוארת כאן.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ANR [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], Fondation pour la Médicale רשרש [תכנית הנדסת ביו – DBS20140930777] ומן LABEX להחיות [ANR-10-LABX-73] אוליבייה Goureau, קריסטל Monville. זה נתמך על ידי NeurATRIS, המחקר translational תשתית (Investissements d’Avenir) עבור biotherapies מדעי המח [ANR-11-INBS-0011], INGESTEM, התשתית הלאומית (Investissements d’Avenir) הנדסה pluripotent ו הבדיל בתאי גזע [ANR-11-INBS-000] כדי קריסטל Monville. כרים בן M’Barek נתמכה על ידי מלגות Stempole דים ו LABEX להחיות [ANR-10-LABX-73]. גזע הוא חלק של המכון Biotherapies מחלות נדירות נתמך על ידי les חדר מרווח וחדיש האגודה הצרפתית Myopathies (AFM)-Téléthon.
Materials
| Sterile biosafety cabinet | TechGen International | Not applicable | |
| Liquid waste disposal system for aspiration | Vacuubrand | BVC 21 | |
| CO2-controlled +37 °C cell incubator | Thermo Electron Corporation | BVC 21 NT | |
| 200 µL pipette: P200 | Gilson | F144565 | |
| 1 mL pipette: P1000 | Gilson | F144566 | |
| Pipet aid | Drummond | 75001 | |
| +4 °C refrigerator | Liebherr | Not applicable | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fine scissors | WPI | 501758 | |
| Forceps (x2) | WPI | 555227F | |
| Water bath | Grant subaqua pro | SUB6 | |
| Precision balance | Sartorius | CP225D | |
| Centrifuge | Eppendorff | 5804 | |
| Microscope | Olympus | SC30 | |
| Horizontal Rocking Shaker | IKA-WERKE | IKA MTS 214D | |
| Vortex | VWR | LAB DANCER S40 | |
| Disposable Scalpel | WPI | 500351 | |
| plastic paraffin film | VWR | PM992 | |
| 0.200 µm single use syringe filter | SARTORIUS | 16532 | |
| Syringe without needle 50 mL | Dutscher | 50012 | |
| Bottles 250mL | Dutscher | 28024 | |
| 15 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352097 | |
| 50 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352098 | |
| culture insert | Scaffdex | C00001N | |
| 60 mm cell culture disches: B6 | Dutscher | 353004 | |
| 12 well cell culture plate | Corning | 3512 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3506 | |
| Razor blades | Ted Pella, Inc | 121-9 | |
| Cyanoacrylate glue | Castorama | 3178040670105 | |
| PBS 1X (500 mL) | Sigma | D8537 | |
| Thermolysine | Roche | 5339880001 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965-026 | |
| KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) | Invitrogen | 12618-013 | |
| MEM-NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-035 | |
| b-mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| CO2-independent medium | GIBCO | 18045-054 | |
| Gelatin | MERCK | 104078 | |
| human amniotic membrane | Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) | Not applicable |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Gehrs, K. M., Anderson, D. H., Johnson, L. V., Hageman, G. S. Age-related macular degeneration–emerging pathogenetic and therapeutic concepts. Annals of Medicine. 38 (7), 450-471 (2006).
- Swaroop, A., Chew, E. Y., Rickman, C. B., Abecasis, G. R. Unraveling a multifactorial late-onset disease: from genetic susceptibility to disease mechanisms for age-related macular degeneration. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 19-43 (2009).
- Khandhadia, S., Cherry, J., Lotery, A. J. Age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 724, 15-36 (2012).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ben M’Barek, K., Regent, F., Monville, C. Use of human pluripotent stem cells to study and treat retinopathies. World Journal of Stem Cells. 7 (3), 596-604 (2015).
- Ben M’Barek, K., et al. Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt’s macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Hsiung, J., Zhu, D., Hinton, D. R. Polarized human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cell monolayers have higher resistance to oxidative stress-induced cell death than nonpolarized cultures. Stem Cells Translational Medicine. 4 (1), 10-20 (2015).
- Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (7), 5087-5096 (2013).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Thomas, B. B., et al. Survival and functionality of hESC-derived retinal pigment epithelium cells cultured as a monolayer on polymer substrates transplanted in RCS rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (6), 2877-2887 (2016).
- Borooah, S., et al. Using human induced pluripotent stem cells to treat retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 37, 163-181 (2013).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise review: Making stem cells retinal: Methods for deriving retinal pigment epithelium and implications for patients with ocular disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells as a tool to model a form of Leber congenital amaurosis. Cellular Reprogramming. 15 (3), 233-246 (2013).
- Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS Cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
- Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10950-10955 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Ilmarinen, T., et al. Ultrathin polyimide membrane as cell carrier for subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium. PloS One. 10 (11), e0143669 (2015).
- Thumann, G., Schraermeyer, U., Bartz-Schmidt, K. U., Heimann, K. Descemet’s membrane as membranous support in RPE/IPE transplantation. Current Eye Research. 16 (12), 1236-1238 (1997).
- Kiilgaard, J. F., Scherfig, E., Prause, J. U., la Cour, M. Transplantation of amniotic membrane to the subretinal space in pigs. Stem Cells International. 2012, 716968 (2012).
- Capeans, C., et al. Amniotic membrane as support for human retinal pigment epithelium (RPE) cell growth. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (3), 271-277 (2003).
- Ohno-Matsui, K., et al. The effects of amniotic membrane on retinal pigment epithelial cell differentiation. Molecular Vision. 11, 1-10 (2005).
- Paolin, A., et al. Amniotic membranes in ophthalmology: long term data on transplantation outcomes. Cell and Tissue Banking. 17 (1), 51-58 (2016).
- Hu, Y., et al. A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer. Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).
- Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent stem cell-based therapies in combination with substrate for the treatment of age-related macular degeneration. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: The Official Journal of the Association. 32 (5), 261-271 (2016).
- Song, M. J., Bharti, K. Looking into the future: Using induced pluripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling. Brain Research. 1638 (Pt A), 2-14 (2016).
- Ramsden, C. M., et al. Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future). Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
- Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
- Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Transplantation of the RPE in AMD. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (5), 516-554 (2007).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
