Ingénierie de tissu d’épithélium pigmentaire rétinien Transplantation-convient dérivées de cellules souches embryonnaires humaines
Summary
Les auteurs décrivent une méthode pour un tissu rétinien composé de cellules épithéliales pigmentaire rétinien dérivés des cellules souches pluripotentes humaines cultivées sur le dessus des membranes amniotiques humaines et de sa préparation pour les greffes dans des modèles animaux de l’ingénieur.
Abstract
Plusieurs pathologies de le œil sur la fonctionnalité et/ou la survie de l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE). Il s’agit de certaines formes de rétinite pigmentaire (RP) et la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). La thérapie cellulaire est l’un des plus prometteurs stratégies thérapeutiques proposées pour soigner ces maladies, avec déjà encourageant les résultats préliminaires chez l’humain. Toutefois, la méthode de préparation de la prothèse a une incidence importante sur ses résultats fonctionnels in vivo. En effet, les cellules RPE greffés comme une suspension cellulaire sont moins fonctionnels que les mêmes cellules transplantées comme un tissu rétinien. Ici, nous décrivons une méthode simple et reproductible pour ingénieur RPE tissu et sa préparation pour une implantation in vivo . Les cellules dérivées de cellules souches pluripotentes humaines RPE sont ensemencées sur un support biologique, la membrane amniotique humain (jambon). Par rapport aux échafaudages artificiels, ce support a l’avantage d’avoir une membrane basale qui se trouve à proximité de la membrane de Bruch où des cellules RPE endogènes sont attachés. Cependant, sa manipulation n’est pas facile, et nous avons mis au point plusieurs stratégies pour sa mise en culture appropriée et préparation à la greffe in vivo.
Introduction
RPE est crucial pour la survie et l’homéostasie des photorécepteurs avec lequel il est étroitement associé à1. Plusieurs conditions pathologiques modifient ses fonctionnalités et/ou de la survie, y compris les RP et AMD.
RP est un groupe de mutations de monogéniques héréditaires qui affectent les fonctions des photorécepteurs ou cellules RPE ou les deux2,3. On estime que les mutations qui affectent spécifiquement le RPE cellules représentent 5 % de RP2. La DMLA est une autre condition où la couche RPE est altérée, perte de la vision en fin de compte à central principal. AMD est causée par les interactions complexes entre des facteurs génétiques et environnementaux et affecte les personnes âgées4,5,6. Selon les projections, AMD sera un sujet de préoccupation pour les patients 196 millions dans le monde en 2020,7. Pour ces troubles, aucun remède efficace n’existe, et l’une des stratégies proposées est la transplantation des nouvelles cellules RPE afin de compenser les morts/non-fonctionnel préexistante RPE cellules8.
Le mode de formulation du produit final doivent être greffés est essentiel pour assurer les meilleurs résultats fonctionnels. Les cellules RPE injectés sous forme de suspension cellulaire, en dépit d’être une méthode simple et directe de la livraison, soulèvent des préoccupations au sujet de leur survie, l’intégration et la fonctionnalité9,10,11,12 , 13. les scientifiques développent plus des formules complexes pour livrer engineered tissu rétinien9,13,14,15,16. Dans ce contexte, nous avons développé une méthode originale pour produire in vitro RPE des tissus qui pourraient être utilisés pour transplantation9.
Les banques de cellules RPE dérivés de cellules souches embryonnaires humaines (ES) sont utilisés dans le présent protocole. Cependant, alternative RPE de cellules provenant de sources différentes cellules (cellules souches pluripotentes induites par l’homme, les cellules primaires de RPE, etc.), les banques et différenciées avec une méthode différente sont également appropriés pour ce protocole. Il comprend la différenciation dirigée de protocoles à l’aide de cytokines et/ou petites molécules17,18,19,20,21,22.
Pour être transplantés, l’ingénierie tissulaire doit être préparé sur un échafaud. En quelques années, les échafaudages différents reposent sur un polymère ou sur une matrice d’origine biologique13,23,24. Ici, le substrat biologique utilisé est le jambon, mais les autres substrats, comme les membranes dénudées de Bruch, pourraient être mises en œuvre. La méthode décrite ici a l’avantage d’utiliser un échafaudage biologique qui concerne davantage l’environnement natif de RPE.
ES cellules dérivées RPE des cellules humaines sont cultivées pendant au moins 4 semaines afin d’être entièrement organisé comme une monocouche de pavés. À ce stade, l’épithélium obtenu est fonctionnel et polarisé9. Enfin, comme ce tissu rides facilement, il est enchâssé dans une fine couche d’un transporteur d’hydrogel pour lui donner plus de rigidité et d’élasticité et de le protéger pendant la procédure d’injection. Ce produit est ensuite stocké à 4 ° C jusqu’au greffage.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons décrit une méthode pour la culture des cellules RPE sur un échafaudage biologique et sa préparation pour l’implantation dans des modèles animaux. Une des étapes critiques du protocole est le maintien de l’orientation du jambon tout au long de la procédure jusqu’à ce que son inclusion dans la gélatine. En effet, l’épithélium native de la membrane est enlevé et sa membrane basale devient exposé9. Les cellules RPE doivent être semées sur le dessus de cette membrane bas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimeraient remercier Jérôme Larghero et Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, Paris, France) pour leur contribution au cours de la mise en place de la méthode décrite ici.
Ce travail a été soutenu par des subventions de l’ANR [GPiPS : ANR-2010-RFCS005 ; SightREPAIR : ANR-16-CE17-008-02], la Fondation pour la Recherche Médicale [programme de Bio-ingénierie – DBS20140930777] et de LABEX revivre [ANR-10-LABX-73] Olivier Goureau et Christelle Monville. Il a été pris en charge par NeurATRIS, une infrastructure de recherche translationnelle (Investissements d’avenir) pour les biothérapies en Neurosciences [ANR-11-INBS-0011] et INGESTEM, l’infrastructure nationale (Investissements d’avenir) ingénierie pour pluripotentes et cellules souches différenciées [ANR-11-INBS-000] à Christelle Monville. Karim Ben M’Barek a bénéficié de bourses de recherche de Stempole DIM et LABEX revivre [ANR-10-LABX-73]. J’ai-tige fait partie de l’Institut de biothérapies des maladies rares, prises en charge par l’Association Française contre les Myopathies (AFM)-Téléthon.
Materials
| Sterile biosafety cabinet | TechGen International | Not applicable | |
| Liquid waste disposal system for aspiration | Vacuubrand | BVC 21 | |
| CO2-controlled +37 °C cell incubator | Thermo Electron Corporation | BVC 21 NT | |
| 200 µL pipette: P200 | Gilson | F144565 | |
| 1 mL pipette: P1000 | Gilson | F144566 | |
| Pipet aid | Drummond | 75001 | |
| +4 °C refrigerator | Liebherr | Not applicable | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fine scissors | WPI | 501758 | |
| Forceps (x2) | WPI | 555227F | |
| Water bath | Grant subaqua pro | SUB6 | |
| Precision balance | Sartorius | CP225D | |
| Centrifuge | Eppendorff | 5804 | |
| Microscope | Olympus | SC30 | |
| Horizontal Rocking Shaker | IKA-WERKE | IKA MTS 214D | |
| Vortex | VWR | LAB DANCER S40 | |
| Disposable Scalpel | WPI | 500351 | |
| plastic paraffin film | VWR | PM992 | |
| 0.200 µm single use syringe filter | SARTORIUS | 16532 | |
| Syringe without needle 50 mL | Dutscher | 50012 | |
| Bottles 250mL | Dutscher | 28024 | |
| 15 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352097 | |
| 50 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352098 | |
| culture insert | Scaffdex | C00001N | |
| 60 mm cell culture disches: B6 | Dutscher | 353004 | |
| 12 well cell culture plate | Corning | 3512 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3506 | |
| Razor blades | Ted Pella, Inc | 121-9 | |
| Cyanoacrylate glue | Castorama | 3178040670105 | |
| PBS 1X (500 mL) | Sigma | D8537 | |
| Thermolysine | Roche | 5339880001 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965-026 | |
| KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) | Invitrogen | 12618-013 | |
| MEM-NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-035 | |
| b-mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| CO2-independent medium | GIBCO | 18045-054 | |
| Gelatin | MERCK | 104078 | |
| human amniotic membrane | Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) | Not applicable |
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