2 光子顕微鏡による促進マウス Bowman 腔のそれによって

ここ記載されているすべてのプロシージャは、機関動物ケアおよび使用委員会のオレゴン健康及び科学大学によって承認されました。 1. セットアップのデモに使用 パッチアンプ用アダプター/ピペット ホルダー; ため直立 2 光子顕微鏡、3 軸ステージ コント ローラー、パッチアンプ用アダプター/ピペット ホルダーと 3 軸コント ローラーを使用します。これらのアイテムのすべての 4 つが必要です。注: 多くの同様のセットアップは利用でき、ピペット顕微鏡ステージ独立の定量的な 3 軸制御があり、顕微鏡が生体内で直立したイメージング用に設定されている限りで十分です。 2 実験的プロトコルを開始する前に必要な資料 FITC-デキストラン、2,000,000 Da 5% 食塩水または腎血管をマークする retroorbital 注射用リン酸緩衝生理食塩水ソリューションを使用します。それは血管に残っているし、フィルター処理を行いませんので、この分子量 (MW) が選択されます。 マシンを引っ張ってホウケイ酸ガラス マイクロ ピペット: 先端は長いテーパー、閉じた設定を使用して 6-10 μ m の先端にマイクロ ピペットを引く (など熱 = 610、速度 = 150、時間 = 250 ms、ループ) マイクロ ピペットの引き手に。45 ° の面取りと軽く炎-ポーランド語。 マイクロ ピペットの量子ドット コーティング: 参照先のプロトコルによると量子ドットを用いたマイクロ ピペット先端をコートします。12 ポリシロキサン腎臓サポート/スペーサー。腎臓サポート/スペーサーをクラフトするのにポリシロキサンのパテを使用します。ポリシロキサン パテから 5 mm 厚の直角菱形 (すなわち、切頂六面体) によってファッション 1 × 1 cm2 。1 つのエッジからポリシロキサンと、菱形の中心の約 70% を占める円の中間の 70% を削除します。24 h 乾燥するポリシロキサンを許可します。図 1を参照してください。 マイクロインジェクター準備: オイルとポリエチレン (PE)-50 チューブ ・ ピペット装荷マイクロ ピペット ホルダーの長さを自動設定。質量分析法を計画すると、perfluorodecalin が必要な鉱物油を使用する場合がありますそれ以外の場合。気密ハミルトン型注射器と perfluorodecalin でいっぱいガラスシリンジを設定します。これは、PE 50 管、ピペット ホルダーに接続されます。 ピペット ピペット ホルダーが、PE 50 チューブとピペットを記入し、前方 PE-50 のピペットから油圧システムを作成し、ハミルトンのオイル充填注射器にチューブ注射器への近位端に接続します。 3. 横ピペット新規手術を介して列をイメージング流体下腎臓へ 注: イメージングのサポート システムと手術準備のアセンブリは、図 1に示すです。20-25 g の重量を量る c57bl/6 マウスで説明されている手順が実行されます。 マウスの重量を量る。 4% イソフルランを用いた麻酔を誘導し、空気/酸素混合物で 1.5-2.5% イソフルランと維持します。痛みを伴う刺激, 呼吸数の減少への応答の不在によってマウスに麻酔がかかることを確認します。 目を注油し、ベース プレートの横方向の動物を配置します。テープを使用して 4 四肢を固定します。 200 μ L、通常生理食塩水を皮下注入し、直腸温度プローブを配置します。イメージング中に手術や加熱パッドの中に暖房ランプを使用して温度を制御します。 脱毛クリームを使用してマウスの左側にあるすべての髪を削除します。 皮膚の下に表示され、脾臓を検索し、脾臓背側および尾側左の腎臓を探します。 皮膚に 0.5 cm の切開を行い、腹膜に小さな切開だけで十分な簡単にを介してプッシュする腎臓。 穏やかな圧力で腎臓を押し出します。腎臓周辺シアノアクリ レート系接着剤で修正ポリシロキサンで作られた腎臓スタビライザー フォームを配置します。その腎臓の外側の表面を超えた安定器約 1 mm で、腎臓をスペーサーと並ぶ。 接着剤で安定剤フォーム ヘッド プレートを修正し、ベース プレートにバーを取り付けにヘッド プレートをマウントします。 1% のアガロース溶液が付いている腎臓を取り巻くポリシロキサン サポートの井戸を埋めるし、上 10 mm coverslip の場所 agarose がしっかりするまで保持します。接着剤で頭プレートに coverslip のシール、歯科用セメントと、coverslip の周りのリングを作成します。 レトロな軌道 FITC デキストラン (2,000,000 Da、5% 溶液、100-150 μ L) を挿入して移動マウスと固定プレート 2 光子励起顕微鏡ステージに迅速に維持麻酔し十分な排ガス顕微鏡ステージ上清掃します。 4. 適切な糸球体とボウマンのスペースにピペット アクセスの選択 定義: 画面の左から右と左-右顕微鏡に直面して X を定義します。 ステージ コント ローラーから SX (ステージ X) を読む ピペット X としてピクセルを定義、ピペット ダイヤル コント ローラー 画面の上下、顕微鏡と 2 光子セットアップの方へ進むと Y を定義します。 床に向かってダウン天井に向かって Z とを定義し、目的の Z 位置をステージ上で測定します。 ステージ (本当に目標) 高さとして S (O) Z を定義します。 腎臓、眼で緑色蛍光タンパク質 (GFP) のフィルター設定を使用して特定の画面を見つけます。FITC デキストラン注入による血管系は明るい緑色になります。 適当な糸球体を識別します。眼を使用して腎臓の表面を識別した後 2 光子 (非走査モード) に切り替え、画像ウィンドウを探索します。それによって有利な特性は次のよう: 垂直距離、coverslip の下 > (アクセス中にピペットと coverslip の間の衝突を防ぐため) に 30 μ m と糸球体に横腎被膜からの距離を横 < 400μ m (この距離を超えてピペットの偏差がの可能性を高める欠場)。 レコード水平・垂直距離を穿刺するポイント、糸球体のピペット側に直接腎被膜上の点。 X を維持、水の列に目的の焦点ポイントを上げるし、y ステージ座標そのまま、ちょうど約センチメートルの距離。 水の列にピペット チップをドライブ、4′, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) 励起入れます。X と y でピペットの先端の最大蛍光の点に寸法、これは目的の中心に移動します。この正確な大のせず眼のピペットを見つけることは難しいです。量子ドット励起波長に関係なく (この場合は、赤) で同じ波長を発するので、DAPI の励起は図 2に示す先端にしっかりと焦点を当てて赤い蛍光性を生成します。 赤色けい光たんぱく質 (RFP) を励起設定を変更し、眼でピペットを可視化し、正確に眼のビューの中央に配置します。 2 光子に切り替え、2 光子、画像の中央に正確に配置することの下でピペットを見つけます。登録ポジションです。 ピペットのイメージを保存します。 ステージとマイクロ ピペット コント ローラー座標を登録します。注: ステージとピペットの座標間のオフセットを計算する JavaScript コード、(インストールされているスプレッドシート ソフトウェアを持っていないシステム上有利な) またはスプレッドシートを使用して計算を実行する補足の .html ファイルを使用して、ピペット コント ローラーのターゲット座標を計算します。 X 軸、z と y を同じ維持で水柱からピペットを削除します。 ピペット Z を Z (すなわち移動、coverslip 以下で Z 方向にダウン ピペット) ターゲット糸球体に移動します。 ピペット Y をターゲット糸球体 Y 座標に移動します。 Z 対象糸球体腎臓の端へと 2 光子ライブ ビューを移動し、SX に注意してください。 腎臓エッジ登録 SX からのオフセットを使用してピクセルを計算します。 腎臓の端がまだ目に見えるが、画面の左側にまでそのピペット (増加 SX) に向けた段階を移動します。 ピクセル計算上腎臓端より約 100 μ m のピペットを迅速に進めます。 ピペット チップ、ピペットをゆっくりと前進を探します。赤のゲインを上げるし、赤のピクセルのヒストグラム (ピクセル分布シフト ピペットの量子ドットとオフのターゲット蛍光の極端な明るさのための] ウィンドウでイメージを作成する前に) を見る。 ライブの 2 光子励起イメージング下腎臓エッジに向かって前進します。注: 腎カプセルに入ると、前にそれは Y および Z 次元でピペットをリダイレクトすることが可能です。ただし、これはピペット チップを破る可能性があります。保守的なメジャー ピペットがターゲット、オフの場合最大 2 cm、リダイレクト、X 次元に腎臓エッジに戻る X 次元に撤退することです。X 以外の任意の軸の運動はピペット屈曲する素晴らしい経験を必要とするに至るピペットは、組織内では、一度使用、および頻繁に破損につながる。 X 軸にゆっくりとつかみなさいターゲット ピクセル、SX に目を光らせてするピペットをドライブします。(時折、マイクロ ピペットの挿入時に全然でシフトしているかどうか参照してくださいに糸球体に戻って便利です)。 Z スタックでの文書の位置の正しい場所にできたら。注: 場所に挿したと薬、蛋白質、または蛍光トレーサーを注射する、流体は、後で分析のため吸気可能性があります。 または圧力または別の電極を基準にして料金を測定することがあります。 5. Bowman 腔からの吸引 設定 100 を注入するマイクロ ピペットの開存性を確保し、ピペットを入力中に差し込むから交絡を削減する perfluorodecalin 2 分以上の nL。ピペット位置を確実に減らせます。 追加のろ過のための 4-6 分を待ちます。 300 までを吸引するポンプを設定まで 50 nL/min の速度で nL。注: 糸球体形態変化は認められないこのレートでは、吸引時にスペースに流体の配信レートは変更されませんを示唆しています。それによって従来のようにオイル ブロックはありませんが、質量分析法に必要なこのボリュームの回復は注入された perflourodecalin とおそらく尿細管液の一部を含めることができます。イオン感応電極測定蛍光分光法、ポリメラーゼの連鎖反応、およびその他の機密性の高いエンドポイントなどの試金、低いボリュームを使用する場合があります。質量がエンドポイントでない場合は、鉱油と標準それによって技術が格納される前に吸気量を測定する使用できます。 もう一度イメージ。 ピペットを撤回し、サンプル、TRIS バッファーを追加し、-80 ° 分析の前に保存を維持します。 イソフルラン、またはその他の承認された方法の過剰摂取を使用してマウスを安楽死させます。注: 濾液糸球体毛細血管からろ過してスペースに入ります。スターリング力支配 SNGFR、しかしと Bowman 腔に負の静水圧は、したがって、SNGFR を高める可能性があります、8-14 nL/分3間マウス単一腎糸球体濾過率 (SNGFR) が報告されます。しかし、これらの化合物は質量分析法 (下記参照) を妨げる、標準それによってメソッドは筒状の流動体のサンプリングのオイルと中立的な圧力、尿細管封鎖を使用します。したがって、この手法では、初期の近位尿細管は特許。さらに、吸引の時に、Bowman 腔には肯定的な濾液量が、未知が含まれています。そのため、流体の吸引率は、SNGFR を超える可能性があります。注: ここで説明する実験、目標だったより大きいを取得する nanoproteomic を用いた質量分析のため糸球体濾液の通常のサンプルより。質量分析の使用鉱物油やワックス (質量分析法の信号: ノイズを低減する有機分子の複雑な混合物) でオイル ブロックの使用を排除するので、perfluorodecalin はマイクロ ピペットと注射器の塗りつぶしに使用します。Perflourodecalin 鋼管の流れをブロックする知られていないしかしは生物学的に不活性と質量と干渉しません。