Micropuncture של השטח של באומן בעכברים בהנחייתם של מיקרוסקופיית פוטון 2

כל ההליכים המתוארים במסמך זה אושרו על-ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים, שימוש הוועדה של אורגון לבריאות & ומדע באוניברסיטת. 1. הגדרת משמש להדגמה השתמש במיקרוסקופ פוטון 2 זקוף, של שלב 3-ציר בקר, בעל headstage/פיפטה ו 3-ציר בקר על בעל headstage/פיפטה; כל ארבעת פריטים אלה נדרשים.הערה: כיוונונים דומים רבים זמינים, יספיק כל עוד שליטה עצמאית 3-ציר כמותית של השלב פיפטה ו במיקרוסקופ הינם זמינים, המיקרוסקופ מוגדר עבור ויוו הדמיה זקוף. 2. חומרים הדרושים לפני הפעלת פרוטוקולים ניסיוני השתמש FITC-לתוספי, דא 2,000,000, 5% פתרון תמיסת מלח או באגירה פוספט תמיסת מלח להזרקה retroorbital לסמן את להערכת כליות. זה משקל מולקולרי (MW) נבחרה משום שהוא נשאר להערכת אינו מסנן. משך-מכונת זכוכית בורוסיליקט micropipettes: למשוך micropipettes 6-10 מיקרומטר קצה באמצעות ההגדרות לונג-טפר, סגור עצה (למשל, חום = 610, מהירות = 150, זמן = ms 250, כרך) על פולר micropipette. מסגרת משופעת כדי 45°, להבה-פולין בקלילות. נקודה קוונטית ציפוי של micropipettes: מעיל micropipette טיפים עם נקודות קוונטיות לפי הפרוטוקול שאליהם יש הפניה. 12 מרווח/תמיכה בכליות ששינינו. השתמש ששינינו פוטי לעצב מרווח/תמיכה של הכליה. אופנה ס”מ 1 x 12 על ידי 5 מ מ עבה ישרי-זווית הצלעות (קרי, קובייה קטומה) מ ששינינו פוטי. הסר את האמצעי 70% ששינינו את מקצה אחד של מעגל הכוללת כ- 70% של מרכז הצלעות. לאפשר את ששינינו להתייבש במשך 24 שעות ביממה. ראה איור 1. Microinjector הכנה: Prefill באורך של פוליאתילן (PE)-50 אבובים, בעל טעינה micropipette micropipette עם שמן. אם ספקטרומטר מסה מתוכנן, perfluorodecalin נדרש, אחרת ניתן להשתמש שמן מינרלי. להגדיר את microinjector עם המילטון-סוג מזרק גז חזק ואת מילוי עם perfluorodecalin. זה יחובר לצנרת PE-50 ומחזיק פיפטה. למקם את פיפטה המחזיק פיפטה ו קדימה תמלא את צינורות PE-50 פיפטה ולאחר מכן הצמד בסוף הפרוקסימלית PE-50 אבובים על המזרק המילטון מלא שמן, יצירת מערכת הידראולית של פיפטה להזריק. 3. פיפטה לרוחב גישה אל הכליה מתחת נוזל הדמיה עמודה באמצעות הליך כירורגי הרומן הערה: מכלול של מערכת תמיכה הדמיה, הכנה כירורגי מוצג באיור1. ההליך המתואר מתבצע על עכברים C57BL/6 במשקל של 20 – 25 גר’. שוקלים את העכבר. לגרום הרדמה באמצעות 4% איזופלוריין ולתחזק עם 1.5-2.5% איזופלוריין בתערובת אוויר/חמצן. לאשר כי העכבר הוא ומורדמת באמצעות היעדר בתגובה לגירוי מכאיב וקצב נשימה מופחתת. לשמן את העיניים ולמיקומו לרוחב בעלי חיים על baseplate. לשתק את 4 הגפיים באמצעות הקלטת. להזריק תמיסת מלח, 200 µL, subcutaneously, במקום בדיקה טמפרטורה רקטלית. בקרת טמפרטורה בעזרת מנורת חימום במהלך הניתוח, כרית החימום במהלך דימות. להסיר את כל השיער על הצד השמאלי של העכבר באמצעות קרם depilatory. לאתר הטחול, הגלויה לעין מתחת לעור, ואתר את הכליות בצד הגבי ו סימטרית של הטחול. להפוך את חתך 0.5 ס מ על העור החתך קטנים יותר הצפק, מספיק רק בשביל הכליה להעביר בקלות. הבלטת הכליה עם לחץ עדין. מקם טופס מייצב כליות עם ששינינו סביב הכליה תיקון עם דבק מגע, דבק. בשורה הכליה עם מרווח כך השטח צדדי ביותר של הכליה חורג המיצב על ידי כ- 1 מ מ. אכין צלחת ראש אל הטופס מייצב עם דבק והר בלוח הראשי הרכבה ברים על הבסיס. למלא את הבאר בתומך ששינינו המקיפים את הכליה עם 1% פתרון agarose, למקם את coverslip 10 מ מ על גבי ממושכת עד agarose הוא המשרד. חותם coverslip לצלחת ראש עם דבק וליצור טבעת מסביב coverslip עם מלט שיניים. מזריקים FITC-לתוספי (2,000,000 Da, 5% פתרון, µL 100 – 150) רטרו-orbitally ולהעביר את הצלחת קיבוע של עכבר לבמה מיקרוסקופים פוטונים 2 במהירות, שמירה על הרדמה ולהבטיח נאותה לבזבז דלק ניקוי על הבמה מיקרוסקופ. 4. הבחירה של פקעית מתאימים או פיפטה גישה למרחב של באומן הגדרות: הגדרת X וגם משמאל לימין על המסך מול המיקרוסקופ משמאל לימין לקרוא SX (שלב X) מן הבקר הבמה מגדירים PX פיפטה X, על פיפטה חיוג בקר מגדירים Y מעלה-מטה על המסך, קדימה כלפי המיקרוסקופ וכלפי בחזרה את הכיוונון פוטון 2 להגדיר Z כמו למעלה לכיוון התקרה, למטה לכיוון הרצפה, ונמדד על הבמה עם העמדה המטרה Z. להגדיר S (O) Z כמו גובה הבמה (באמת המטרה). למצוא את פני השטח של הכליה, לזיהוי באמצעות הגדרות המסנן חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) העינים. עקב ההזרקה של FITC-לתוספי, להערכת יהיה ירוק בהיר. זיהוי של פקעית מתאימים. לאחר שזיהו את פני השטח של הכליה באמצעות את העינים, לעבור 2-פוטון (מצב שאינו לסריקת) ולחקור את החלון הדמיה. תכונות חיוביות של micropuncture הן הבאות: המרחק האנכי מתחת coverslip > 30 מיקרומטר (כדי למנוע התנגשות בין פיפטה coverslip במהלך גישה), לרוחב שהמרחק הקפסולה כליות לרוחב פקעית < 400 מיקרומטר (מעבר במרחק הזה סטיית פיפטה עשוי להגדיל את הסבירות של פספוס). לרוחב הרשומה והמרחק האנכי כדי לנקב הצבע, נקודת על הקפסולה כליות ישירות לצד פיפטה פקעית. להעלות מוקד אובייקטיבית לתוך עמודת המים, שמירה על ה-x ואת y הבמה קואורדינטות ללא שינוי, מרחק של בערך סנטימטר. כונן את הטיפ פיפטה לתוך עמודת המים והפעל 4′, עירור (דאפי) 6-diamidino-2-phenylindol. הזז פיפטה ב- x ו- y מידות עד לנקודה של זריחה מקסימלי של הקצה, זה יהיה מרכז המטרה. למצוא את פיפטה העינים קשה ללא prepositioning הזה מדויק. כי נקודות קוונטיות לזרוח על הגל אותו (במקרה זה, אדום) ללא קשר עירור הגל, עירור דאפי מייצרת פלואורסצנטי אדום אשר מתמקדת בחוזקה הטיפ, מאויר באיור2. שנה את הגדרת עירור חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP), להמחיש את פיפטה ב העינים, לאחר מכן בדיוק מרכז זה בתצוגה עינית. לעבור ל 2-פוטון ולמצוא את פיפטה תחת 2-פוטון, הצבתו בדיוק במרכז התמונה. זהו המיקום רישום. לשמור תמונה של פיפטה. לרשום את הבמה ואת הקואורדינטות בקר micropipette.הערה: השתמש את קובץ html משלימות, אשר יבצע חישובים באמצעות קוד JavaScript, (יתרון במערכות שאין המותקן בתכנת) או גיליון אלקטרוני לחישוב ההיסט בין קואורדינטות הבמה ו פיפטה וכדי חישוב הציון של המטרה עבור בקר ה-פיפטה. הסר את פיפטה עמודת המים בציר x, שמירה z ו- y זהה. לעבור על פיפטה Z פקעית היעד Z (קרי, להעביר פיפטה למטה בכיוון Z מתחת coverslip) להעביר את פיפטה Y הקואורדינטה פקעית Y היעד. להזיז את התצוגה בשידור חי 2-פוטון של פקעית היעד Z ולאחר מכן על הקצה של הכליה ורשום את SX. לחשב את הקצה כליות PX באמצעות ההיסט של הרישום SX. להעביר את הבמה לכיוון פיפטה (עלייה SX) כך הקצה של הכליה היא הרחק בצד שמאל של המסך, אבל עדיין נראה לעין. לקדם את פיפטה במהירות כ-100 מיקרומטר פחות הקצה כליות PX החישוב לעיל. אתר הטיפ פיפטה, לקדם את פיפטה לאט. להגדיל את הרווח אדום ולצפות ההיסטוגרמה פיקסל אדום (הפיקסל הפצה משמרות לפני פיפטה זה עם תמונה בחלון, עקב הבהירות קיצוני של נקודות קוונטיות, זריחה את המטרה). מראש לקצה כליות תחת הדמיה פוטון 2 בשידור חי.הערה: לפני הכניסה הקפסולה כליות, אפשרי לנתב מחדש את פיפטה בממדים Y ו- Z. עם זאת, זה עלול להתנתק הטיפ פיפטה. מדד יותר שמרני, אם פיפטה היעד, הוא לסגת בממד X עד 2 ס מ ניתוב מחדש, ואז שובו בממד X לקצה כליות. ברגע פיפטה בתוך הרקמה, תנועה בציר כל פרט X מוביל כיפוף פיפטה הדורש ניסיון רב כדי להפוך את השימוש, ולעיתים קרובות מוביל שבירה. נסיעה פיפטה על ציר ה X לאט אל המטרה להידבק PX, עין SX. (זה עוזר לחזור מדי פעם פקעית כדי לראות אם זה השתנה בכלל על החדרת micropipette). כשאתה במיקום הנכון, מסמך עמדה עם z-מחסנית.הערה: עם micropipette במקום, תרופות, חלבונים, או פלורסנט המשדרים עשוי להיות מוזרק, נוזל עלול להיות aspirated לניתוח בשלב מאוחר יותר או אולי ניתן למדוד לחץ או תשלום יחסית אלקטרודה נוספת. 5. השאיפה של נוזל מהחלל של באומן להגדיר את micropump כדי להזריק 100 nL של perfluorodecalin יותר מ 2 דקות כדי להבטיח patency של פיפטה לצמצם בלבול של פיפטה חיבור במהלך הזנת. Reimage כדי להבטיח מיקום פיפטה. לחכות 4-6 דקות עבור סינון. להגדיר את micropump מחוק לגמרי עד 300 nL בשיעור של עד 50 nL/min.הערה: השינויים מורפולוגיה glomerular שאינם קיימים בקצב הזה, מציע שזה אינו משנה את קצב משלוח של נוזל למרחב בזמן השאיפה. מאחר אין גוש שמן כמו micropuncture המקובלת, שחזור של אמצעי אחסון זה, הכרחי עבור ספקטרומטר מסה, עשוי לכלול חלק perflourodecalin מוזרק נוזל ואולי צינורי. עבור מבחני כגון אלקטרודות יון רגיש מדידות קרינה פלואורסצנטית ספקטרוסקופיה, תגובת שרשרת פולימראזית נקודות הקצה רגיש האחרות, כרכים התחתון עשוי לשמש. אם ספקטרומטר מסה אינה נקודת הקצה, שמן מינרלי וטכניקות micropuncture רגיל יכול לשמש כדי למדוד את עוצמת הקול aspirated לפני האחסון. תמונת פעם נוספת. למשוך את פיפטה ולשמר את הדגימה, הוספת טריס מאגר ואחסון ב-80 מעלות לפני ניתוח. המתת חסד העכבר באמצעות מנת יתר של איזופלוריין או שיטה אחרת שאושרו.הערה: פילטרט של מזין את החלל על ידי סינון מן הנימים glomerular. קצב הסינון glomerular יחיד-נפרון (SNGFR) בעכברים הוא דיווח בין 8 – 14 nL לדקה3 כוחות סטרלינג למשול SNGFR, עם זאת, לחץ הידרוסטטי שלילי בחלל של באומן ולכן עשוי להגביר SNGFR. שיטות micropuncture רגיל להשתמש המצור צינורי עם שמן ולחץ נייטרלי לדיגום נוזלים צינורי, אולם תרכובות אלו להפריע ספקטרומטר מסה (ראו להלן); לכן, בטכניקה זו המקורבת המוקדמות נשאר פטנט. יתר על כן, בזמנו של שאיפה, השטח של באומן מכיל לא ידוע, אבל נפח חיובי של פילטרט. לכן, השאיפה נוזלים קצב עשוי לעלות SNGFR.הערה: בניסויים המתוארים כאן, המטרה הייתה להשיג גדול יותר מאשר מדגם הרגיל של פילטרט של glomerular לניתוח ספקטרומטר מסה בטכניקות nanoproteomic. מאז השימוש ספקטרומטר מסה מונע שימוש של שמן בלוקים עם שמן מינרלי או שעווה (תערובות מורכבים של מולקולות אורגניות המקטינים האות: רעש ספקטרומטר מסה) perfluorodecalin משמש כדי למלא את micropipette ואת המזרק. Perflourodecalin לא ידוע לחסום את זרימת צינורי, אבל לא פעיל מבחינה ביולוגית, לא מפריע ספקטרומטר מסה.