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Immunology and Infection

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォーム/赤痢菌属

Published: November 07, 2018
doi:
10.3791/58200
, , , ,
1State Key Laboratory of Diarrhea Disease Detection,Zhuhai International Travel Healthcare Center

Summary

サルモネラ赤痢は下痢に起因する一般的な病原体。ここでは、サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォームについて述べる/リアルタイム PCR を用いた赤痢ガイド文化と組み合わせます。

Abstract

急性胃腸炎の糞口頭伝達発生時間の時間から、食料と水を処理する人がサルモネラ属/Shigella属菌に感染している場合は特にサルモネラ属/Shigella属菌の検出法のゴールド スタンダードは直接文化ですが手間と時間がかかる。ここでは、サルモネラ属/Shigella属菌スクリーニング、リアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 導かれた文化と組み合わせるを使用しての高スループット プラットフォームについて述べる。2 つの主要な段階があります: リアルタイム PCR とガイド付きの文化。最初のステージ (リアルタイム PCR)、我々 はメソッドの各ステップを説明する: コレクション、前濃縮、DNA の抽出、PCR のサンプルします。リアルタイム PCR の結果が肯定的な場合 (ガイド文化) の 2 番目の段階を実行: 選択的文化、生化学的同定と血清学的解析。我々 はまたそれから生成された代表的な結果を示しています。ここで説明されているプロトコルは、サルモネラ属菌の迅速な特定、機密、高スループット スクリーニングのための貴重なプラットフォームになる/赤痢菌属

Introduction

下痢はまだ発生率が高いと一般的な健康問題レート1,2は、グローバルです。何人かの患者が週間 (ゆったりと水様便、バスルームに行き緊急) などの様々 な症状を示す死亡率が比較的低いが、経済効果の非常に高い3,4になります。もっと真剣に、一部の患者は過敏性腸症候群を開発可能性がありますも場合未処理5を左します。細菌、ウイルス、下痢6を引き起こす可能性が寄生虫の様々 な種類があります。サルモネラ属菌/赤痢、急性胃腸炎7,8,9,10,11の伝達のための最も一般的な細菌の中で。したがって、多くの郡が定期的サルモネラの法令を発行している/赤痢菌属は、食料や水の処理と人々 の間でスクリーニングします。たとえば、中国の政府は義務のサルモネラのための法律を発行している/赤痢菌属は、年に一度をスクリーニングします。

サルモネラ属菌の金本位法/赤痢菌属検出細菌文化。細菌文化と連続の生化学的同定と血清学的性状、を介して疾患アウトブレイク管理と抗菌薬の患者の治療を支援するためにプロファイリングを容易にすることができる細菌の種を識別できます。12.サルモネラ属中の感染のソースをトレースにも役立つかもしれない/赤痢菌属の発生13。ただし、このメソッドは、(手動操作を必要とする) 手間と時間のかかる (数日かけて)、特に多数のサンプル7のテストします。さらに、(VBNC)サルモネラ属菌培養が可能な/赤痢菌属がいくつかの糞便に存在する14。これらの欠点の観点から多くの実験室はサルモネラ属菌の検出のための新しい手法の開発を試してみました/赤痢菌属15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25します。 これらすべてのメソッドは、その中でポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) は最も一般的な核酸増幅テスト (NAAT) を使用します。これらの NAAT ベースのメソッドの 1 つの主要な制限は死菌、細菌も破片含んでいる不完全なゲノム DNA が肯定的な結果26、主病の正確な診断に影響を与える可能性がありますを示すことができます。ブランコらは、その分子アッセイが可能なサルモネラの文化でも部分的なゲノムと過去の感染または汚染26から死んだまたは実行不可能な細菌だけではなく、機密性の高いを示しました。したがって、新しい技術を開発する必要があります。

ここでは、コンバイン、NAAT ベースの法と培養法について述べる。図 1に示すように、この新しいメソッドに適用されるリアルタイム PCR の最初のスクリーニング、細菌培養と同定のための肯定的なサンプルの送信されます。

Protocol

プロトコル珠海国際旅行健康管理センターの人間研究倫理委員会の定めたガイドラインに従います。実験中に標準的な滅菌操作を使用してください。 1 培地の組成と調製 栄養流体培養基の準備: 1% ペプトン、牛肉エキス 0.3%、0.5% 塩化ナトリウム、H2O で 0.1% ブドウ糖を溶解、7.5 とオートクレーブに pH 調整 121 ° C、15 分で。 亜セレン酸シスチン メ?…

Representative Results

サルモネラ属菌のスクリーニングに応用プロトコル/アナル便で赤痢が食料や水を扱うだろう人たちからサンプルします。 リアルタイム PCR のステップ図 5Aに示すようにあった混合サンプルは、サルモネラ属菌の陽性を意味する HEX チャネルに正常な拡大肯定的な 1 つ?…

Discussion

サルモネラ属菌以来/赤痢、食中毒や急性胃腸炎28,29の糞便口頭伝達に関連付けられてと定期的な方法は手間や時間がかかる7、サルモネラ属の高スループット プラットフォームについて述べる/赤痢菌属のスクリーニング、リアルタイム PCR を用いたガイド文化と組み合わせます。

こ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、科学と技術プログラムの珠海、中国 (許可番号 20171009E030064)、科学と技術プログラムの広東省、中国 (許可番号 2015A020211004) と科学と技術プログラムの一般的な管理によって支えられました。品質監督、検査および中国 (許可番号 2016IK302、2017IK224) の共和国の検疫。

Materials

Tris Sigma 10708976001
EDTA Sigma 798681
NP40 Sigma 11332473001
ddH2O Takara 9012
PrimeSTAR HS (Premix) Takara R040Q
Nutrient Broth LandBridge CM106
Nutrient agar LandBridge CM107
Selenite Cystine medium LandBridge CM225
XLD LandBridge CM219
MAC  LandBridge CM908
Salmonella chromogenic agar CHROMagar SA130
Salmonella diagnostic serum Tianrun SAL60
Shigella diagnostic serum Tianrun SHI54
anal swab (collecting tube plus) Huachenyang
slide Mingsheng 7102
micro-loop Weierkang W511
incubator Jinghong DNP-9082
autoclave AUL SS-325
dry bath Jinghong KB-20
automated microbial identification system bioMérieux VITEK2 other equivalent system could be used
fluorescent real-time PCR machine ThermoFisher ABI7500 other equivalent machine could be used
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SalmonellaShigellaHigh-throughput ScreeningNAATReal-time PCRCulture IdentificationPathogensVibrioStaphylococcusE. ColiPre-enrichmentCentrifugationDNA ExtractionReal-time PCRSelenite Crystal MediumColony SelectionAutomated Microbial IdentificationO-antigen CharacterizationH-antigen Characterization

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Yang, Z., Chen, X., Tu, C., Su, Y., Wang, H. A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.. J. Vis. Exp. (141), e58200, doi:10.3791/58200 (2018).
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