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Medicine

Un approccio In Vitro alla terapia fotodinamica

Published: August 17, 2018
doi:
10.3791/58190
,
1Department of Dermatology,University of California, Davis, 2Dermatology Service,Sacramento VA Medical Center, 3Department of Dermatology,State University of New York, Downstate Medical Center

Summary

Terapia fotodinamica (PDT) è una procedura medica che coinvolge l’incubazione di un fotosensibilizzatore esogenicamente applicata (PS) seguita dalla fotoattivazione di luce visibile di indurre apoptosi. Vi presentiamo un protocollo in vitro PDT progettato per simulare PDT che possono essere utilizzate per studiare le differenze nei parametri di trattamento con la luce e incubazione di PS.

Abstract

Terapia fotodinamica (PDT) è una procedura medica che coinvolge l’incubazione di un fotosensibilizzatore esogenicamente applicata (PS) seguita da luce visibile fotoattivazione di indurre apoptosi delle cellule. La Federal Drug Administration ha approvato PDT per il trattamento della cheratosi attinica, e le linee guida cliniche consigliano PDT come trattamento per alcuni tumori della pelle non melanoma e acne vulgaris. PDT è una modalità terapeutica vantaggiosa come è basso costo, non invasivo e associato con eventi avversi minimi e spaventare. Nel primo passaggio della PDT, un PS è applicato e accumulo intracellulare. Irradiazione di luce successiva induce la formazione di specie reattive dell’ossigeno, che può infine condurre ad apoptosi delle cellule, rottura della membrana, danno mitocondriale, modulazione immune, proliferazione dei cheratinociti e fatturato di collagene. Qui, presentiamo un metodo in vitro per studiare PDT in una linea cellulare aderente. Questo tipo di terapia è progettato per simulare PDT e può essere regolato a studiare l’uso della PDT con varie linee cellulari, fotosensibilizzanti, temperature d’incubazione o fotoattivazione lunghezze d’onda. Carcinoma a cellule squamose cellule sono stato incubato con 0, 0.5, 1.0 e 2 mM l’acido 5-aminolevulinico (5-ALA) per 30 min e fotoattivazione con 417 nm blu luce per 1.000 s. La misura primaria di risultato era apoptosi e necrosi, come misurato tramite Annessina-V e 7-aminoactinomycin D flusso cytometry. C’era un aumento dose-dipendente in apoptosi dopo trenta minuti incubazione di 5-ALA. Per raggiungere alta validità Inter-test, è importante mantenere coerente incubazione e parametri di luce, durante gli esperimenti in vitro PDT. PDT è che un’utile ricerca clinica di routine e in vitro può consentire lo sviluppo di romanzo PSs, ottimizzazione di protocolli e nuove indicazioni per PDT.

Introduction

Terapia fotodinamica (PDT) è una procedura medica che coinvolge l’incubazione di un fotosensibilizzatore esogenicamente applicata (PS) seguita da luce visibile fotoattivazione di indurre apoptosi delle cellule. La Federal Drug Administration (FDA) ha approvato PDT per il trattamento delle cheratosi attiniche (AK), e le linee guida cliniche consigliano PDT come trattamento per alcuni tumori della pelle non melanoma e acne vulgaris1,2. Usi non-dermatologiche emergenti per PDT includono trattamento di cancri gastrointestinali, della prostata e ginecologici3. PDT è una modalità terapeutica vantaggiosa in quanto è basso costo, non invasivo e associate a eventi avversi minimi e cicatrici2.

Nel primo passaggio della PDT, un PS è applicato e accumulo intracellulare2. Negli Stati Uniti, acido 5-aminolevulinico topico (5-ALA) è comunemente usato per trattare AKs. Durante l’incubazione fase, 5-ALA viene convertita in protoporfirina IX (PP-IX) via la via di biosintesi del heme in cellule costituite3. Le cellule di cancro e pre-cancro sono diminuiti ferrochelatase attività, che converte la protoporfirina IX (PP-IX), il prodotto finale, EME. Di conseguenza, le cellule di cancri si accumulano PP-IX rispetto a cellule normali4,5. Questo accumulo di PP-IX in cancro e cellule pre-tumorali rispetto al tessuto circostante permette di PDT essere un approccio mirato con minimi effetti avversi. Irradiazione di luce porta alla generazione di specie (ROS) dell’ossigeno reattivo quando ossigeno accetta elettroni eccitati da PP-IX. PP-IX ha un assorbimento di picco nello spettro ultravioletto con cime più piccole tutto lo spettro di luce visibile, tra cui blu e rosso luce2. Formazione di ROS può infine condurre ad apoptosi delle cellule, rottura della membrana, danno mitocondriale, modulazione immune, proliferazione dei cheratinociti e collagene fatturato6,7,8,9 , 10.

PDT è stato sviluppato nel 1970 ed è una modalità terapeutica in evoluzione3. Il protocollo approvato dalla FDA per il trattamento di AKs consiglia di incubazione di 5-ALA pelle per 14 – 18 h, ma le incubazioni 1 o 2 h sono comunemente utilizzate nella pratica clinica2. In vitro, abbiamo dimostrato che più breve 15 min incubazioni di 5-ALA possono aumentare apoptosi delle cellule del fibroblasto rispetto ai fibroblasti non trattati11,12. Inoltre, romanzo chlorin, ftalocianina e basata su nanoparticelle PSs stanno studiandi per migliorare efficacia di PDT3. Qui, presentiamo un metodo in vitro per studiare PDT in un carcinoma di cellule squamous aderente celle. In questo protocollo, SCC-13 le cellule vengono incubate con 0, 0.5, 1.0 e 2 mM 5-ALA per 30 min e fotoattivazione con 417 nm blu luce per 1.000 s. La misura primaria di risultato è apoptosi e necrosi, come misurato tramite Annessina-V e 7-aminoactinomycin D (7-AAD) flusso cytometry. Questo tipo di terapia è progettato per simulare PDT e può essere regolato a studiare l’uso della PDT con altre linee cellulari, fotosensibilizzanti, temperature d’incubazione o fotoattivazione lunghezze d’onda. Preparazione dei gruppi di controllo aggiuntive può essere necessarie, tra cui non macchia, unico fluoroforo macchiato, controlli positivi e negativi per citometria a flusso. Una rassegna completa della teoria, protocolli, disegno sperimentale e gating per apoptosi/necrosi flusso cytometry può essere trovata altrove13.

Protocol

1. preparazione delle celle Piastra di 20.000 celle in 2 mL di terreno di coltura in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti utilizzando una tecnica sterile in una cappa di biosicurezza. Posizionare piastre da 6 pozzetti in un incubatore (37 ° C, 5% CO2) per 24 h permettere alle cellule di aderire alle piastre. 2. preparazione del fotosensibilizzatore per il trattamento delle cellule Preparare soluzioni di 5-ALA di 0,5, 1 e 2 mM in terreno di coltura. Se il siero bovino fetale (FBS) è un ingrediente del terreno di coltura, preparare e curare le cellule con 5-ALA in soluzione di mezzo di coltura con 0,1% FBS per le incubazioni. 11 , 12 In questo caso, SCC-13 celle non richiedono FBS, quindi 5-ALA è stato aggiunto direttamente al medium privo di siero del keratinocyte completato con bovina estratto pituitario ed il fattore di crescita epidermico. Aspirare il terreno di coltura e lavare le cellule con almeno 2 mL di tampone fosfato salino (PBS). Aspirare la PBS e aggiungere 2 mL di 0, 0,5, 1 o 2 mM soluzioni di 5-ALA in pozzi o piastre separate. Incubare le cellule con 0, 0,5, 1 o 2 mM 5-ALA su un 36 a 37 ° C Riscaldamento blocco per 30 min. proteggere le cellule da esposizione alla luce durante l’incubazione con foglio di alluminio. Le soluzioni di 5-ALA 0, 0,5, 1 e 2 mM di aspirare e lavare le cellule con 2 mL di PBS. Aspirare la PBS e aggiungere 2 mL di terreno di coltura per irradiazione di luce blu. 3. blue Light fototerapia Prima irradiando le cellule, accendere il dispositivo luminoso blu (ad es., diodi emettitori di luce, fluorescente o alogena) ed eseguire per un ciclo (1.000 s) per riscaldare il dispositivo. Il dispositivo luminoso blu dovrebbe avere una lunghezza d’onda di uscita di 417 + /-5 nm. Consentendo al dispositivo di eseguire per un ciclo prima di trattamenti assicura che la lunghezza d’onda di luce blu e irradianza sono coerenti in tutta la fase di fotoattivazione. Utilizzare un fotometro per misurare la radiazione alla superficie delle cellule. L’irraggiamento di luce blu alla superficie delle cellule dovrebbe essere di 10 mW/cm2. La distanza tra la luce e le celle potrebbe essere necessario regolare per ottenere un’irradiazione di 10 mW/cm2 a seconda dell’intensità della sorgente luminosa. Posizionare i gruppi di trattamento di ALA 0, 0,5, 1 e 2 mM su una superficie nera sotto la sorgente di luce blu. Irradiare le cellule con luce blu per 1.000 s (16 min e 40 s) per un totale fluence di 10 J/cm2. A seguito di fotoattivazione di luce blu, le cellule sono pronte per l’analisi. 4. raccolta e colorazione Preparare il tampone di flusso secondo le linee guida del produttore (Vedi Tabella materiali). Aspirare il terreno di coltura e lavare le cellule con 2 mL di PBS. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA 0.25% e permettono alle cellule di staccare per circa 3-5 min. Le cellule possono essere esaminate al microscopio per confermare il distacco delle cellule. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura (o PBS) con 10% siero bovino fetale per disattivare la tripsina. Raccolta di sospensione cellulare in tubi di flusso con etichetta 5ml. Rotazione tubo di flusso 5ml in una centrifuga a 201 x g per 5 min, aspirato soluzione senza rimuovere il pellet cellulare. Aggiungere 200 µ l di tampone di flusso con anticorpo coniugato Annessina-V (1 µ l di annessina-v a 39 µ l di tampone di flusso) per ogni campione. Risospendere le cellule e collocare nell’incubatrice (37 ° C, 5% CO2) per 20 minuti consentire il legame di annessina-V. Aggiungere 3 µ l di 7-AAD a ciascun campione. Incubare per 5 min a temperatura ambiente. 5. l’analisi citofluorimetrica Attenersi alle linee guida del produttore di citometro a flusso per set-up (Vedi Tabella materiali). Raccogliere e analizzare campioni con citometria a flusso. 13 Eseguire un confronto statistico di trattamento ed i gruppi di controllo mediante analisi della varianza (ANOVA)14. Confrontare i mezzi per i gruppi di trattamento per la media del controllo con test di Dunnett, una per l’analisi post hoc .

Representative Results

Dopo SCC-13 le cellule sono state incubate per 30 min con 0, 0,5, 1 e 2 mM 5-ALA e irradiate con 1.000 s di luce blu, c’era un aumento dose-dipendente nell’apoptosi delle cellule. Apoptosis totale (media ± errore standard della media) era 3.94 ± 0.34, 7,90 ± 0,52, 23.86 ± 0,52 e ± 38.33 1,81 dopo 30 min di incubazione con 0, 0,5, 1 e 2 mM 5-ALA, rispettivamente e 1000 secondi di blu chiaro (Figura 1). Abbiamo confrontato la percentuale media di apoptotic delle cellule tra 0, 0,5, 1 e 2 mM 5-ALA incubate gruppi mediante ANOVA. Le cellule trattate con 1 e 2 mM 5-ALA ha avuto un aumento significativo nell’apoptosi delle cellule rispetto a 0 mM 5-ALA cellule trattate. La Figura 2A Mostra rappresentativa flusso cytometric gating di forward scatter (FSC) contro dispersione laterale (SSC) per SCC-13 cellule incubate con 0, 0,5, 1 e 2 mM 5-ALA. Il gating cerchio racchiude la popolazione delle cellule di SCC-13. Per questo esperimento, 7500 eventi sono stati raccolti e il cancello di popolazione cellulare SCC-13 catturato almeno il 90% degli eventi. Figura 2B illustra un rappresentanza terreno di 7-AAD sull’asse x e Annessina-V sull’asse y. Le popolazioni delle cellule sono gated in quattro quadranti (Q1 a Q4) di discriminare le cellule apoptotiche. Q1 in fase precoce apoptosi di cellule (alta annessina-v, basso 7-AAD) rappresenta. Cellule di Q2 (alta annessina-v, alta 7-AAD) rappresentano in fase tardiva apoptosi o necrosi. Cellule di Q3 (basso annessina-v, alta 7-AAD) rappresenta in fase di necrosi. Rappresenta (basso annessina-v, basso 7-AAD) Q4 cellule non subire apoptosi o necrosi. Per calcolare la percentuale delle cellule che subiscono gli apoptosi, abbiamo aggiunto la percentuale delle cellule in Q1 e Q2. Incoerenza nella lunghezza di periodo di incubazione di 5-ALA, temperatura di incubazione o dose di irradiazione di fotoattivazione può alterare l’efficacia della PDT. Figura 3 viene illustrato un complotto di cytometric flusso Annessina-V e 7-AAD rappresentanza quando varia la temperatura di incubazione (cioè, 27, 36 o 42 ° C). C’era un aumento di temperatura dipendente in apoptosi. Figura 1: aumento Dose-dipendente in apoptosi dopo trenta minuti di incubazione di 5-ala 5-ALA incubato a 36 ° C per trenta minuti seguiti da 1.000 s di luce blu in cellule SCC-13. Barre rappresentano la media delle percentuali Annessina-V cellule positive in ogni trattamento e gruppo di controllo. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplice copia tecnica. Significatività statistica è stata determinata mediante ANOVA, con p < 0,05 contrassegnati da un asterisco (*). Barre di errore rappresentano la media ± errore standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: rappresentante flusso Cytometry trame. (A) rappresentante forward scatter vs lato grafici a dispersione cytometry in unità arbitrarie (AU) per x – e asse y per le cellule incubate 5-ALA di 0, 0,5, 1 e 2 mM. Per questo esperimento, 7500 eventi sono stati raccolti e catturato il cancello di popolazione cellulare SCC-13 90% degli eventi. (B) rappresentante Annessina-V vs 7-AAD flusso cytometry terreni a AU per x – e asse y per le cellule incubate 5-ALA di 0, 0,5, 1 e 2 mM. Q1: prime cellule apoptotiche, Q2: tarda cellule apoptotiche/necrotiche, Q3: cellule necrotiche e Q4: cellule vitali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: 5-ALA a diverse temperature di incubazione possono alterare l’efficacia della PDT. Citometria a flusso nel rappresentante Annessina-V vs 7-AAD terreni a AU per x – e asse y per SCC-13 cellule incubate con 0.5 mM 5-ALA al 27, 36 e 42 ° C. Q1: prime cellule apoptotiche, Q2: tarda cellule apoptotiche/necrotiche, Q3: cellule necrotiche e Q4: cellule vitali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

C’era un importante crescita in apoptosi SCC-13 dopo 30 min incubazioni di 0,5, 1 e 2 mM 5-ALA seguita da 1.000 s di luce blu. Questi risultati sono coerenti con la nostra ricerca precedentemente pubblicato che dimostrano che le incubazioni di 5-ALA di 30 min seguita da attivazione luce blu porta ad un aumento dose-dipendente della percentuale delle cellule del fibroblasto che subiscono apoptosi12, 14.

Questo approccio sperimentale per studiare PDT presenta vantaggi e limitazioni. I metodi descritti sono conformi alla pratica clinica come un PS commercialmente disponibile e fonte di luce sono stati usati. I ricercatori possono personalizzare i metodi con diversi tipi di cellule, PSs, fonti di luce e parametri di irradiazione. Tuttavia, ci sono limitazioni di questo approccio come questo protocollo è progettato per coltivate in un monostrato di cellule aderenti. Nella pratica clinica, le differenze in architettura o malattia patologia del tessuto (cioè, ipercheratosi o fibrosi) possono ridurre assorbimento di PS o penetrazione15di luce. Di conseguenza, le dosi di trattamento ed i risultati sperimentali non possono direttamente corrispondono alla pratica clinica. Modelli di tumore sferoide e chip microfluidico sono stati studiati come metodi per replicare più strettamente tumore microambienti16,17,18. Sferoidi hanno nicchie cellulare interni ed esterni che differenzialmente potrebbero incorporare i fotosensibilizzanti e rappresentano l’architettura di tumore eterogeneo. Altri ricercatori hanno utilizzato chip microfluidici per condizioni di trattamento dello schermo e consegna vascolare di fotosensibilizzatori. Tuttavia, chip microfluidici può essere costoso per sviluppare o difficili da implementare per i ricercatori non hanno familiari con la tecnica. Inoltre, sferoidi e chip microfluidici potrebbero non riflettere il trattamento clinico dei tumori della pelle in cui fotosensibilizzanti sono applicati direttamente alla superficie del tumore senza diffusione vascolare. I ricercatori potrebbero essere necessario valutare i pro e i contro della cultura dello strato monomolecolare, modelli del tumore sferoide e chip microfluidici per studiare PDT in sistemi differenti di malattia. Come non esistono cellule immunitarie o matrice extracellulare, non è possibile determinare come PDT colpisce interazioni cellula-cellula complessa. I ricercatori potrebbero essere necessario confermare in vitro risultati sperimentali utilizzando modelli animali e studi clinici. Per raggiungere alta validità Inter-test, è importante mantenere coerente incubazione e parametri di luce, durante gli esperimenti in vitro PDT.

Temperatura è noti per alterare l’efficacia della PDT19. Uno studio ha dimostrato che la morte delle cellule, l’assorbimento di 5-ALA, PP-IX formazione e rilascio di citochine possono essere migliorate incubando le cellule con 5-ALA a temperature fino a 44 ° C19. Temperature di incubazione superiori a 44 ° C possono portare alla morte cellulare indotta termici e temperature di incubazione inferiore a 20 ° C non possono portare a significativo 5-ALA assorbimento e accumulo19. Si consiglia di ricercatori eseguano le incubazioni PS su un blocco di temperatura regolabile riscaldamento ad una temperatura costante di controllo per la confusione potenzialmente effetti termici. Inoltre, è importante Incubare il fotosensibilizzatore per una quantità sufficiente di tempo per consentire la conversione di 5-ALA in PP-IX. In questo protocollo, SCC-13 cellule sono state incubate con 5-ALA per 30 min, che con successo ha indotto apoptosi delle cellule. Precedentemente abbiamo dimostrato che una 10 min di incubazione di 5-ALA non ha significativamente aumentato gli apoptosi nei fibroblasti rispetto al controllo non trattato fibroblasti11,14. PP-IX inizia ad accumulare nella pelle del topo dopo incubazione di 5-ALA per sei minuti a 37 ° C. Pertanto, dopo dieci minuti di incubazione di 5-ALA, potrebbe non esserci sufficiente accumulo di PP-IX per indurre apoptosi di cellule20. Si consiglia un periodo di incubazione minimo di 20 a 30 min per 5-ALA basato su nostri precedenti studi11,14. I ricercatori potrebbero essere necessario ottimizzare il periodo di incubazione basato sul laboratorio impostazione, fotosensibilizzatore di interesse, tipo di cella e indicazione clinica. Esperimenti di titolazione e ottimizzazione dell’anticorpo possono essere eseguiti per ottenere i migliori risultati utilizzando le linee guida del produttore. Altri saggi di interesse possono essere eseguite seguendo la fotoattivazione di luce blu tra cui diidroetidio Quantificazione cytometric di flusso del ROS. 14

Variazione della quantità di luce trasportato per unità di superficie (cioè, irraggiamento) e dose di irradiazione totale (cioè, fluence) durante la fase di fotoattivazione può influenzare la formazione di ROS e di apoptosi delle cellule21. Il rapporto tra fluenza, irradianza e ora può essere descritto dalla seguente equazione:

Fluenza (J/cm2) = irraggiamento (W/cm2) x tempo (s)

Come fluence dipende dal tempo, accorciando o allungando le fasi di fotoattivazione cambiano l’efficacia del trattamento. L’irraggiamento è proporzionale alla distanza al quadrato tra la sorgente luminosa e il tessuto bersaglio. Di conseguenza, se la luce è troppo lontano, potrebbe non esserci sufficiente energia luminosa consegnato al tessuto mirato per eccitare la PS. in alternativa, l’irraggiamento può essere aumentata di luce che si riflette le superfici circostanti. Pertanto, si consiglia di eseguire irradiazioni di luce con le piastre per colture cellulari collocate su una superficie nera per impedire la riflessione della luce. I ricercatori possono acquisire commercialmente disponibili o approvato dalla FDA blu light – emitting diode e fluorescente dispositivi da utilizzare in esperimenti di PDT, ma questi dispositivi possono avere diverse potenze e uniformità di campo chiaro. Un fotometro di lunghezza d’onda specifica dovrebbe essere utilizzato per misurare l’irraggiamento presso la superficie delle cellule e l’uniformità del campo chiaro prima di ogni esperimento per ottenere risultati coerenti. Un diffusore disponibile in commercio può essere utilizzato per migliorare l’uniformità di campo, se necessario.

In sintesi, abbiamo descritto un approccio in vitro ad indagare PDT da dettagli teoria, metodi sperimentali, limitazioni, potenziali insidie e consigli per l’ottimizzazione. PDT è che un’utile ricerca clinica di routine e in vitro può consentire lo sviluppo di romanzo PSs, ottimizzazione di protocolli e nuove indicazioni per PDT.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori non hanno nessun ringraziamenti.

Materials

Keratinocyte serum free medium  Thermofisher 17005042 Culture medium for SSC-13 cells
DMEM low glucose glutamax Thermofisher 10567022 Possible culture medium for other cell types
6-well culture plates Thermofisher 720083
PBS Thermofisher 14190250
0.25% Trypsin-EDTA Thermofisher 25200056
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermofisher 15250061 For cell counting and plating 
BLU-U light  DUSA Request from manufacturer Other blue LED, flourescent, or halogen lights may used 
5-ALA DUSA Request from manufacturer
FBS Atlanta Biologicals C17032
FlowCellect Annexin Red Kit Millipore Sigma  FCCH100108  Propidium iodide may replace 7-AAD. Comes with annexin-V, 7-AAD, and flow buffer
FACSCanto II BD Request from manufacturer Any flow cytometer may be used 
Counting Chamber Hausser 3120 For cell counting and plating 
FlowJo FlowJo Request from manufacturer Flow cytometry analysis software
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References

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Austin, E., Jagdeo, J. An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy. J. Vis. Exp. (138), e58190, doi:10.3791/58190 (2018).
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