Miktar hipopigmentasyon aktivitesinin in Vitro
Summary
Biz kimyasallar tüp bebek hipopigmentasyon etkinliğini değerlendirmek için üç deneysel yöntemleri tarif: miktar 1) hücresel Tirozinaz etkinlik ve 2) melanin içerik ve 3) melanin hücresel melanin boyama ve görüntü analizi tarafından ölçümü.
Abstract
Bu çalışmada miktar hipopigmentasyon faaliyet tüp bebek için laboratuvar yöntemleri sunar. Melanin, melanosit, büyük pigment birden çok hücresel ve çevresel faktörler cevaben sentezlenir. Melanin cilt hücrelerini ultraviyole zararlardan korur, ama aynı zamanda biyofiziksel ve biyokimyasal işlevleri vardır. Aşırı üretimi veya melanosit melanin birikimi çiller, siyah noktaları, melazma ve benler gibi dermatolojik sorunlara neden olabilir. Bu nedenle, hipopigmentasyon ajanlar ile melanogenesis kontrolünü klinik veya kozmetik ihtiyaçları olan bireylerde önemlidir. Melanin öncelikle melanosit etkilenir melanogenesis dışsal olarak adlandırılan karmaşık biyokimyasal bir süreç ve hormonlar, iltihap, yaş ve ultraviyole ışık pozlama gibi Intrinsic faktörler melanosomes sentezlenir. Biz, kimyasal madde veya melanosit doğal maddelerin hipopigmentasyon etkinliğini belirlemek için üç yöntem tarif: 1) hücresel Tirozinaz etkinlik ve 2) melanin içerik ve görüntü ile 3) Boyama ve sayısal hücresel melanin ölçüm analiz.
Melanogenesis, L-tirozin 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) ve sonra dopaquinone içine dönüştürür hızı sınırlaması adım Tirozinaz tromboksan. Bu nedenle, Tirozinaz inhibisyonu bir birincil hipopigmentasyon mekanizmadır. Kültürlü melanosit içinde Tirozinaz etkinlik L-DOPA bir substrat ekleyerek ve dopaquinone üretim spectrophotometry tarafından ölçme sayısal. Melanogenesis da melanin içerik miktarının ölçmek. Melanin içeren hücresel kesir NaOH ile elde edilir ve melanin spectrophotometrically sayılabilir. Son olarak, melanin içerik Fontana-Masson melanin boyama aşağıdaki görüntü analizi tarafından sayılabilir. Her ne kadar bu tüp bebek deneyleri sonuçlarını insan cilt her zaman yeniden değil, bu yöntemler melanogenesis araştırma, potansiyel hipopigmentasyon etkinliği tanımlamak için özellikle ilk adımı olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntemler, melanosit etkinlik, büyüme ve farklılaşma değerlendirmek için de kullanılabilir. Üç farklı yöntem tutarlı sonuçlar etkileri geçerliliğini sağlamak.
Introduction
Melanin fizyolojisi, patoloji ve toksikoloji cilt, göz ve beyin1de dahil olmak üzere çeşitli organlarının kritik bir rol oynamaktadır. Büyük melanin fotoğraf-tarama ve biyokimyasal etkileri işlevlerdir. Melanin ultraviyole radyasyon, ışığın daha kısa dalga boyları artan emme oranları ile yanı sıra yakın kızılötesi ve görünür ışık emer; Böylece, melanin görünür ışık veya UV radyasyon2neden hasar dokuları korur. Melanin bir antioksidan ve metaller ve diğer toksik kimyasal maddeler için bir ilgi vardır; Bu nedenle, o-ebilmek korumak dokulara kimyasal ve oksidatif stres3. Ancak, aşırı melanin üretimini dermatolojik sorunlarına neden olur.
Miktar ve kalite melanin deride ve iris Iris ve cilt rengini en önemli belirleyicileri vardır. Bireyler farklı cilt renk tercihleri olabilir; diğerleri daha açık cilt renkleri lehine iken bazı tabaklanmış deri, iyilik. Bu tüketici profilleri bağlı olarak hipopigmentasyon kozmetik bireysel pazarlar için tercih cilt renkleri4karşılamak için geliştirilmiştir. Buna göre bilimsel ve pratik çalışmalar hipopigmentasyon ve anti-melanogenic aktivitesinin önemlidir.
Melanogenesis melanin biyosentezi melanosit vücudunda kimyasal reaksiyonlar enzimatik ve spontan bir dizi karmaşık işlemidir. Bir melanosit yaklaşık 36 lenfositi tarafından çevrilidir ve melanosit komşu lenfositi onların ürün dağıtmak melanin sentezini fabrikaları vardır. Deride, üretilen ve melanosit melanosomal bölümünde depolanan melanin dendrites epidermis ile komşu lenfositi için taşınır.
L-tirozin 3,4-dihydroxyphenylalanine (BASINCIN) ve sonra dopaquinone içine dönüştürmek iki ardışık tepkileri melanogenesis ve enzim Tirozinaz için ilk substrat tromboksan L-Tyrosine hizmet vermektedir. Bu tepkiler melanogenesis5,6hızı sınırlaması adım vardır. Buna göre hipopigmentasyon etkinlik ilk doğrudan hücresel Tirozinaz etkinliğini değerlendirmek tarafından ölçülebilir. Bunu yapmak için melanosit özleri içeren Tirozinaz BASINCIN ile inkübe ve örnekleri üretilen dopaquinone spectrophotometry, 475 tarafından ölçülebilir nm. Değerleri örnekleri ve hipopigmentasyon faaliyet sonucu denetimleri ile karşılaştırıldığında daha az dopaquinone oluşumunda maddelerle protein konsantrasyonları tarafından normalleştirilmiş.
İkinci olarak, hipopigmentasyon etkinlik melanin kültürlü melanosit içinde doğrudan ölçerek sayısal. Test materyalini hücrelerle tedavi sonra melanin alkali koşullarda elde edilir ve melanin içerik spectrophotometry 400 tarafından sayısal nm. Hipopigmentasyon Ajan daha düşük bir melanin içerik denetimleri7daha neden olur.
Son olarak, hipopigmentasyon etkinlik Fontana-Masson melanin boyama ve sonraki görüntü analizi tarafından sayısal. Fontana-Masson boyama, melanin granülleri amonyak-gümüş nitrat görünür bir siyah metalik durumuna azaltmak ve hücrelerin mikroskobik görüntüler siyah alanlar melanin miktarı gösterir.
Hipopigmentasyon Aracısı genellikle hangi madde etkinliği geçerli olduğunu doğrular Bu üç yöntem ile tutarlı ve benzer sonuçlar verir. Alternatif olarak, bu ifade anahtar genler ve proteinler arasında melanogenesis yanıt hipopigmentasyon etkinliğini incelemek için bir test madde olarak ölçmek yararlı olabilir. Tirozinaz yanı sıra, Tirozinaz kaynaklı proteinler (TRP-1) ve dopachrome tautomerase (TRP-2) kritik melanogenesis8enzimlerdir. Transkripsiyon faktörü mikroftalmia ilişkili transkripsiyon faktörü (MITF) melanogenesis ve miktar onun gen/protein ifade düzeylerinin ana bir düzenleyicisidir veya bir organizatörü etkinliği tahlil hipopigmentasyon etkinliğini değerlendirmek için de kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz kültürlü melanosit kullanarak test bileşiklerin hipopigmentasyon etkinliğini değerlendirmek için protokol sundu. Temsil edici sonuçlar arbutin, Tirozinaz etkinlik ve hücresel melanin içerik inhibe bir Tirozinaz inhibitörü hipopigmentasyon etkisini gösterdi. Bu yöntemler anti-melanogenic aktivite araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu deneyleri kullanarak, biz de başarıyla geçmişte melanogenesis B16F10 hücreleri üzerinde inhibitör etkisi olduğu birçok biyoaktif bileşikler belirl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Kore Enstitüsü planlama ve değerlendirme için gıda, tarım ve Ormancılık (IPET) Tarım Bakanlığı, gıda ve kırsal işleri (MAFRA tarafından finanse edilen ağrı-Bioindustry teknoloji geliştirme programı aracılığıyla teknolojisi tarafından desteklenen ) (116159-02-2-WT011) ve okul Yaşam Bilimleri ve biyoteknoloji BK21 Plus, Kore Üniversitesi.
Materials
| 3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine | Sigma | D9628 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | #320145 | |
| Arbutin | Fluka | #10960 | |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | |
| FBS | HyClone | SH30084.03 | |
| Formalin | Yakuri Pure Chemicals | #16223 | 37% |
| Gold chloride | American MasterTech | AHG0226 | 0.10% |
| HCl | Samchun chemical | H0255 | |
| KCl | Bio basic Canada Inc. | PB0440 | |
| KH2PO4 | Sigma | #60218 | |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | #3817-01 | |
| NaCl | Duksan pure chemicals | #81 | |
| NaOH | Sigma | 655104 | |
| Nuclear fast red | Merck | 100121 | Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate. |
| Penicillin and streptomycin solution | HyClone | SV30010 | |
| Silver nitrate | Duksan Pure Chemicals | #900 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | J.T. Baker | #3817-01 | |
| Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) | Sigma | S5011 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Duksan Pure Chemicals | #2163 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Bio Basic Canada | TB0196 | |
| Triton X-100 | Union Carbide | T8787 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma | T3824 | 25 KU |
References
- Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells. Pigment Cell & Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Galvan, I., Solano, F. Melanin chemistry and the ecology of stress. Physiological and Biochemical Zoology. 88 (3), 352-355 (2015).
- Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners. Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).
- Cooksey, C. J., et al. Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase. Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).
- Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase. Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).
- Gillbro, J. M., Olsson, M. J. The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents – existing and new approaches. International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).
- Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes. Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).
- Lee, J. H., et al. Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes. Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression. Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).
- Jun, H. J., et al. p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis. European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibition of γ-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism. Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).
- Choi, Y. M., et al. Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes. European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).
- Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes. Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).
- Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation. Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).
- D’Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E. Signaling pathways in melanogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1144 (2016).
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).
- Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. α-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes. Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).
- Hu, D. N. Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).
- Carriel, V. S., et al. A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).
