Quantificação de hipopigmentação atividade In Vitro
Summary
Nós descrevemos três métodos experimentais para avaliar a atividade de hipopigmentação de produtos químicos em vitro: quantificação do conteúdo de atividade e 2) melanina tirosinase 1) celular e 3) medição de melanina por celular melanina mancha e análise de imagem.
Abstract
Este estudo apresenta métodos de laboratório para a quantificação de hipopigmentação atividade in vitro. Melanina, o pigmento principal em melanócitos, é sintetizada em resposta a múltiplos fatores celulares e ambientais. A melanina protege as células da pele de dano ultravioleta, mas também tem funções biofísicas e bioquímicas. Produção excessiva ou acúmulo de melanina nos melanócitos pode causar problemas dermatológicos, como sardas, manchas, melasma e moles. Portanto, o controle da melanogênese com hipopigmentação agentes é importante em indivíduos com necessidades clínicas ou cosméticos. Melanina é sintetizada principalmente nas melanossomas dos melanócitos em um complexo processo bioquímico chamado melanogênese, que é influenciado por extrínsecos e fatores intrínsecos, como hormônios, inflamação, idade e exposição à luz ultravioleta. Nós descrevemos três métodos para determinar a atividade de hipopigmentação de produtos químicos ou substâncias naturais em melanócitos: medição da atividade de tirosinase 1) celular e conteúdo de melanina 2) e 3) coloração e quantificação celular melanina com imagem análise.
Na melanogênese, tirosinase catalisa a etapa limitante que converte a L-tirosina em 3,4-dihidroxifenilalanina (l-dopa) e depois em dopaquinone. Portanto, a inibição da tirosinase é um mecanismo primário hipopigmentação. Em melanócitos cultivados, atividade de tirosinase pode ser quantificada pela adição de l-dopa como substrato e produção de dopaquinone de medição por espectrofotometria. Melanogênese também pode ser medido através da quantificação do conteúdo de melanina. A fração celular contendo melanina é extraída com NaOH e melanina é quantificada espectrofotometricamente. Finalmente, o conteúdo de melanina pode ser quantificado por análise de imagem após coloração de Fontana-Masson de melanina. Embora os resultados desses ensaios in vitro não podem sempre ser reproduzidos na pele humana, estes métodos são amplamente utilizados na pesquisa da melanogênese, especialmente como o passo inicial para identificar potenciais hipopigmentação atividade. Esses métodos também podem ser usados para avaliar a atividade dos melanócitos, crescimento e diferenciação. Resultados consistentes com os três diferentes métodos garantir a validade dos efeitos.
Introduction
A melanina desempenha um papel crítico na fisiologia, patologia e toxicologia de vários órgãos, incluindo a pele, olhos e cérebro1. As principais funções de melanina são efeitos foto-triagem e bioquímicos. A melanina absorve a luz infravermelha e visível, bem como a radiação ultravioleta (UV), com taxas de aumento de absorção em comprimentos de onda mais curtos de luz; assim, a melanina protege tecidos dos danos causados pela luz visível ou UV radiação2. A melanina é um antioxidante e tem uma afinidade com metais e outros produtos químicos tóxicos; Portanto, pode proteger os tecidos de estresse oxidativo e químicas3. No entanto, a produção excessiva de melanina provoca problemas dermatológicos.
A quantidade e a qualidade de melanina na pele e íris são os mais importantes determinantes da cor da íris e da pele. Os indivíduos podem ter preferências de cor de pele diferente; alguns favorecem uma pele bronzeada, enquanto outros favorecem a cores de pele mais claras. Dependendo desses perfis de consumidor, hipopigmentação cosméticos foram desenvolvidos para satisfazer cada um dos mercados para pele favorecido cores4. Da mesma forma, estudos de atividade hipopigmentação e antifato são importantes, tanto cientificamente como na prática.
Melanogênese é o processo complexo de biossíntese de melanina através de uma série de reações químicas enzimáticas e espontâneas em melanócitos. Um melanócito é cercado por aproximadamente 36 queratinócitos e melanócitos são as fábricas de síntese de melanina que distribuem seus produtos para os queratinócitos vizinhos. Na pele, a melanina produzida e armazenada no compartimento de partir dos melanócitos é transportada para queratinócitos vizinhos nos epiderme através de dendritos.
L-tirosina serve como substrato inicial para a melanogênese e a tirosinase enzima catalisa duas reações consecutivas que convertem a L-tirosina em 3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA) e depois em dopaquinone. Estas reações são o passo limitante na melanogênese5,6. Por conseguinte, hipopigmentação atividade primeiro pode ser medida avaliando a atividade de tirosinase celular diretamente. Para fazer isso, melanócito extratos contendo tirosinase são incubados com DOPA e o dopaquinone produzido nas amostras pode ser medido por espectrofotometria em 475 nm. Os valores são normalizados pelas concentrações de proteína das amostras e substâncias com resultado de atividade hipopigmentação em menos formação de dopaquinone em comparação com controles.
Em segundo lugar, atividade hipopigmentação pode ser quantificada através da medição de melanina nos melanócitos cultivados diretamente. Após tratamento de células com o material de teste, a melanina é extraída sob condições alcalinas e o conteúdo de melanina é quantificado por espectrofotometria em 400 nm. Um agente de hipopigmentação resultará em um menor conteúdo de melanina que os controles7.
Finalmente, a atividade de hipopigmentação pode ser quantificada pela coloração de Fontana-Masson melanina e análise de imagens subsequentes. Na coloração de Fontana-Masson, grânulos de melanina reduzem nitrato de amônia-prata para um estado visível de preto metálico e as áreas pretas de células em imagens microscópicas representam a quantidade de melanina.
Um agente de hipopigmentação geralmente dá resultados consistentes e comparáveis com estes três métodos, que confirma que a atividade da substância é válida. Alternativamente, pode ser útil medir a expressão de genes-chave e proteínas na melanogênese em resposta a uma substância de teste para examinar a atividade hipopigmentação. Além de tirosinase, proteínas relacionadas a tirosinase (TRP-1) e dopachrome dopachrome (TRP-2) são enzimas essenciais na melanogênese8. O fator de transcrição microphthalmia-associado do fator de transcrição (MITF) é um mestre regulador na melanogênese e quantificação dos seus níveis de expressão de gene/proteína ou um ensaio de atividade do promotor também pode ser usado para avaliar a atividade de hipopigmentação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apresentamos os protocolos para avaliar a atividade de hipopigmentação de compostos de teste usando melanócitos cultivados. Os resultados representativos mostraram o efeito de hipopigmentação de arbutin, um inibidor da tirosinase que inibiu o conteúdo de melanina de celular e atividade de tirosinase. Estes métodos são amplamente utilizados na investigação de actividade antifato. Usando estes ensaios, nós identificamos também com êxito vários compostos bioativos que possuem efeitos inibitórios melanogênese…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Instituto de Coreia de planejamento e avaliação de tecnologia em alimentos, agricultura e silvicultura (IPET) através do programa de desenvolvimento de tecnologia agro-Bioindustry, financiado pelo Ministério da agricultura, alimentação e Assuntos rurais (MAFRA ) (116159-02-2-WT011) e escola de Ciências da vida e biotecnologia para BK21 PLUS, Universidade de Coreia.
Materials
| 3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine | Sigma | D9628 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | #320145 | |
| Arbutin | Fluka | #10960 | |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | |
| FBS | HyClone | SH30084.03 | |
| Formalin | Yakuri Pure Chemicals | #16223 | 37% |
| Gold chloride | American MasterTech | AHG0226 | 0.10% |
| HCl | Samchun chemical | H0255 | |
| KCl | Bio basic Canada Inc. | PB0440 | |
| KH2PO4 | Sigma | #60218 | |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | #3817-01 | |
| NaCl | Duksan pure chemicals | #81 | |
| NaOH | Sigma | 655104 | |
| Nuclear fast red | Merck | 100121 | Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate. |
| Penicillin and streptomycin solution | HyClone | SV30010 | |
| Silver nitrate | Duksan Pure Chemicals | #900 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | J.T. Baker | #3817-01 | |
| Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) | Sigma | S5011 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Duksan Pure Chemicals | #2163 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Bio Basic Canada | TB0196 | |
| Triton X-100 | Union Carbide | T8787 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma | T3824 | 25 KU |
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