培養色素脱失活動の定量化
Summary
化学物質の in vitro の色素脱失活性を評価するための 3 つの実験的方法を述べる: 1) 細胞のチロシナーゼ活性および 2) メラニン コンテンツ、および 3) メラニン細胞のメラニン色素染色と画像解析による測定の定量化。
Abstract
本研究では、色素脱失活性の in vitro の定量化のための実験方法を示します。メラニンは、メラノサイトの主要な色素は、複数の細胞および環境要因への応答で合成されます。メラニンは紫外線のダメージから皮膚細胞を保護、生物物理学的および生化学的な機能を持っています。過剰生産やメラノサイトでメラニンの蓄積は、そばかすやシミ、肝斑、ほくろなどの皮膚の問題を引き起こす可能性が。したがって、メラニン色素脱失エージェントのコントロールは重要な臨床的または化粧品ニーズを持つ個人です。メラニンは、メラノサイト メラニンに強く影響を外因性と呼ばれる複雑な生化学的過程とホルモン、炎症、年齢、紫外線暴露などの内的因子のメラノソームで主に合成されています。我々 は化学物質やメラノサイトの天然物質の色素脱失アクティビティを決定する 3 つの方法を記述する: 1) 細胞のチロシナーゼ活性・ 2) メラニン コンテンツ イメージ 3) 染色および定量化の細胞メラニンの測定解析。
メラニン形成、チロシナーゼは 3, 4-ジヒドロキシフェニルアラニン (L-DOPA) にし、dopaquinone に L-チロシンに変換する律速段階を触媒します。したがって、チロシナーゼの阻害、主色素脱失メカニズムです。培養メラノサイトでチロシナーゼ活性は基板として L-DOPA を追加し、dopaquinone の生産を吸光光度法による測定で定量化できます。メラニンは、メラニン コンテンツを定量化することで測定できます。NaOH でメラニン含有細胞分画を抽出し、メラニンが光光度法による定量化されます。最後に、次のメラニンのフォンタナ ・ マッソン染色画像解析によるメラニン コンテンツを定量化することができます。これらの試験管内アッセイの結果が常に人間の皮膚で再現することができません、これらのメソッドは、潜在的な色素脱失の活動を識別する最初のステップとして特に広くメラニン形成研究で使用します。これらのメソッドは、メラニン細胞の活性・成長・分化を評価するためにも使用できます。3 つの異なる方法で一貫した結果では、効果の有効性を確認します。
Introduction
メラニンは、生理学、病理学、皮膚、目、脳1などいくつかの臓器の毒物学で重要な役割を果たしています。メラニンの主要な機能は、写真審査と生化学的な効果です。メラニンは uv (紫外線) 放射、光の短波長の光で増加した吸収率と同様、近赤外、可視光を吸収します。したがって、メラニンは、可視光や紫外線放射2によるダメージから組織を保護します。メラニンの酸化防止剤、金属および他の有毒化学物質に親和性を持ってしたがって、それは、化学的酸化ストレス3から組織を保護できます。ただし、メラニンの過剰生産は、皮膚の問題を引き起こします。
肌や虹彩のメラニンの質と量は、アイリスと肌の色の最も重要な要因です。個人があります異なる肌の色の設定;明るい皮膚色を好む他、日焼けした肌、賛成します。これらの消費者プロファイルに応じて化粧品色素脱失を支持された肌の色4の個々 の市場を満たすために開発されています。したがって、科学的に、実質的に、色素脱失、抗メラニン活性研究が重要です。
メラニンは、メラノサイトでの酵素および自発の化学反応の一連のメラニン生合成の複雑なプロセスです。1 つの色素は約 36 ケラチノ サイトに囲まれ、メラノサイトは、メラニン合成工場隣接のケラチノ サイトへの彼らの製品を配布します。皮膚、近隣の樹状突起を介して表皮ケラチノ サイトにメラニン色素の生産し、メラニン細胞の melanosomal のコンパートメントに格納されているで運ばれています。
L-チロシンをメラニン形成と酵素チロシナーゼの初期基板は 3, 4-ジヒドロキシフェニルアラニン (DOPA) にし、dopaquinone に L-チロシンに変換 2 つの連続した反応を触媒する提供しています。これらの反応メラニン形成5,6の率制限ステップであります。したがって、色素脱失活動は、まず直接細胞のチロシナーゼ活性を評価することによって測定できます。ドーパと孵化させるメラニン細胞エキスのチロシナーゼが含まれているようにとサンプルで生産 dopaquinone 475 に吸光光度法によって測定できる nm。値は、サンプル、およびコントロールと比較して少ない dopaquinone 形成における色素脱失活動結果と物質のタンパク質の濃度によって正規化されます。
第二に、培養メラノサイトでメラニンを直接測定することにより色素脱失活動を定量化することができます。試験材料とセルを扱う後、メラニンがアルカリ条件下で抽出され、メラニン コンテンツを 400 で吸光光度法で定量 nm。色素脱失エージェントはコントロール7より低いメラニン コンテンツになります。
最後に、フォンタナ ・ マッソン メラニン染色とそれに続く画像解析による色素脱失活動を定量化することができます。フォンタナ ・ マッソン染色にメラニン顆粒が見える黒い金属状態にアンモニア硝酸銀を減らすし、細胞顕微鏡画像の黒の領域は、メラニンの量を表します。
色素脱失のエージェントは、通常物質の活動が有効であることを確認これらの 3 つの方法の一貫性と同等の結果を与えます。また、メラニン色素脱失活性を調べるテスト物質に応答のキー遺伝子そして蛋白質の発現を測定する有用な場合があります。チロシナーゼ、に加えてチロシナーゼ関連タンパク質 (TRP-1) と dopachrome tautomerase (TRP 2) がメラニン形成8の重要な酵素です。メラニン形成とその遺伝子・ タンパク質発現レベルの定量化のマスター調節因子である転写因子小眼球関連転写因子 (MITF) またはプロモーターの活性測定法は色素脱失活性を評価するためにも使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
培養メラノサイトを用いた試験化合物の色素脱失活性を評価するためのプロトコルを提案します。代表的な結果は、アルブチン、チロシナーゼの活性と細胞のメラニン コンテンツを抑制するチロシナーゼ阻害剤の色素脱失の効果を示した。これらのメソッドは抗メラニン活性研究で広く使用されます。これらの試金を使用して、我々 はまた、正常に B16F10 細胞のメラニン合成阻害効果が過去…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、韓国研究所の計画と評価における食品・農業・林業 (IPET) 農水省・食品・農村情勢 (マフラによって資金を供給、農業バイオ技術開発プログラムを通じて技術によって支えられました。) (116159-02-2-WT011) 生命科学部と bk 21 プラス、韓国大学バイオ テクノロジー。
Materials
| 3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine | Sigma | D9628 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | #320145 | |
| Arbutin | Fluka | #10960 | |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | |
| FBS | HyClone | SH30084.03 | |
| Formalin | Yakuri Pure Chemicals | #16223 | 37% |
| Gold chloride | American MasterTech | AHG0226 | 0.10% |
| HCl | Samchun chemical | H0255 | |
| KCl | Bio basic Canada Inc. | PB0440 | |
| KH2PO4 | Sigma | #60218 | |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | #3817-01 | |
| NaCl | Duksan pure chemicals | #81 | |
| NaOH | Sigma | 655104 | |
| Nuclear fast red | Merck | 100121 | Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate. |
| Penicillin and streptomycin solution | HyClone | SV30010 | |
| Silver nitrate | Duksan Pure Chemicals | #900 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | J.T. Baker | #3817-01 | |
| Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) | Sigma | S5011 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Duksan Pure Chemicals | #2163 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Bio Basic Canada | TB0196 | |
| Triton X-100 | Union Carbide | T8787 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma | T3824 | 25 KU |
References
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