Quantificazione di Hypopigmentation attività In Vitro
Summary
Descriviamo tre metodi sperimentali per la valutazione dell’attività di hypopigmentation di sostanze chimiche in vitro: quantificazione del contenuto di attività e melanina 2) 1) cellulare tirosinasi e 3) misurazione della melanina di melanina cellulare colorazione e analisi delle immagini.
Abstract
Questo studio presenta metodi di laboratorio per la quantificazione di hypopigmentation attività in vitro. Melanina, il pigmento più importante nei melanociti, è sintetizzata in risposta a più fattori cellulari e ambientali. Melanina protegge le cellule della pelle da danno ultravioletto, ma ha anche funzioni biochimiche e biofisiche. Eccessiva produzione o accumulo di melanina nei melanociti possa causare problemi dermatologici, come lentiggini, macchie scure, melasma e talpe. Di conseguenza, il controllo della melanogenesi con agenti di ipopigmentazione è importante in individui con esigenze cliniche o cosmetici. Melanina è sintetizzata principalmente nei melanosomi dei melanocytes in un complesso processo biochimico chiamato melanogenesi, che sono influenzata dalla estrinseca e fattori intrinseci, quali ormoni, l’infiammazione, l’età e l’esposizione alla luce ultravioletta. Descriviamo tre metodi per determinare l’attività di ipopigmentazione dei prodotti chimici o sostanze naturali nei melanociti: misura della attività della tirosinasi 1) cellulare e contenuto 2) della melanina e melanina cellulare 3) colorazione e quantificare con immagine analisi.
Nella melanogenesi, tirosinasi catalizza la tappa limitante che converte L-tirosina in 3,4-diidrossifenilalanina (l-dopa) e poi in Dopachinone. Di conseguenza, l’inibizione della tirosinasi è un meccanismo primario hypopigmentation. In melanociti coltivati, attività della tirosinasi può essere quantificato l’aggiunta di l-dopa come substrato e misurando dopachinone produzione mediante spettrofotometria. Melanogenesi possono anche essere misurata da quantificare il contenuto di melanina. La frazione cellulare melanina-contenenti è estratta con NaOH e melanina è misurata spettrofotometricamente. Infine, il contenuto di melanina può essere quantificato mediante analisi d’immagine seguendo Fontana-Masson colorazione della melanina. Anche se i risultati di queste analisi in vitro non possono essere sempre riprodotto in pelle umana, questi metodi sono ampiamente utilizzati nella ricerca di melanogenesi, soprattutto come il passo iniziale per identificare potenziali attività di ipopigmentazione. Questi metodi possono essere utilizzati anche per valutare l’attività dei melanociti, la crescita e la differenziazione. Risultati coerenti con i tre diversi metodi garantiscono la validità degli effetti.
Introduction
Melanina svolge un ruolo critico nella fisiologia, patologia e tossicologia di diversi organi tra cui la pelle, occhi e cervello1. Le principali funzioni di melanina sono effetti foto-screening e biochimici. Melanina assorbe la luce visibile e vicino infrarosso, così come la radiazione ultravioletta (UV), con tassi di assorbimento aumentato a lunghezze d’onda più corta della luce; così, melanina protegge i tessuti dai danni causati dalla luce visibile o UV radiazione2. Melanina è un antiossidante e ha un’affinità per metalli e altre sostanze chimiche tossiche; di conseguenza, può proteggere tessuti dallo stress ossidativo e chimica3. Tuttavia, l’eccessiva produzione di melanina provoca problemi dermatologici.
La quantità e qualità di melanina nella pelle e iris sono le determinanti più importanti del colore dell’iride e della pelle. Gli individui possono avere preferenze di colore di pelle differente; alcuni favoriscono la pelle abbronzata, mentre altri preferiscono colori più chiari di pelle. A seconda di questi profili di consumo, ipopigmentazione cosmetici sono stati sviluppati per soddisfare i singoli mercati per pelle favorito colori4. Di conseguenza, gli studi di attività, l’ipopigmentazione e anti-melanogenic sono importanti sia scientificamente e praticamente.
Melanogenesi sono il processo di biosintesi di melanina attraverso una serie di reazioni chimiche spontanee e non enzimatici nei melanociti. Un Melanocita è circondato da circa 36 cheratinociti e melanociti sono le fabbriche di sintesi di melanina che distribuiscono il loro prodotto ai keratinocytes vicini. In pelle, la melanina prodotta e memorizzati nel vano melanosomal dei melanociti è trasportata ai keratinocytes vicini nell’epidermide tramite dendriti.
L-tirosina serve come il substrato iniziale per melanogenesi e l’enzima tirosinasi catalizza due reazioni consecutive che convertono L-tirosina in 3,4-diidrossifenilalanina (DOPA) e poi in Dopachinone. Queste reazioni sono la tappa limitante nella melanogenesi5,6. Di conseguenza, ipopigmentazione attività prima può essere misurata valutando attività tirosinasica cellulare direttamente. Per farlo, gli estratti di melanociti contenente tirosinasi sono incubati con DOPA e il dopachinone prodotta nei campioni può essere misurata mediante spettrofotometria a 475 nm. I valori sono normalizzati dalle concentrazioni di proteine dei campioni e delle sostanze con risultato di attività di hypopigmentation in meno formazione dopachinone rispetto ai comandi.
In secondo luogo, ipopigmentazione attività può essere quantificato misurando la melanina in melanociti coltivati direttamente. Dopo trattando le cellule con il materiale di prova, la melanina viene estratto in condizioni alcaline e il contenuto di melanina è quantificato mediante spettrofotometria a 400 nm. Un agente di ipopigmentazione si tradurrà in un minor contenuto di melanina che la controlli7.
Infine, l’attività di ipopigmentazione può essere quantificata dalla Fontana-Masson melanina macchiatura e analisi delle immagini successive. Nella macchiatura di Fontana-Masson, granuli di melanina riducono il nitrato di ammoniaca-argento allo stato metallico nero visibile e le zone nere delle cellule in immagini microscopiche rappresentano la quantità di melanina.
Un agente di hypopigmentation dà solitamente risultati coerenti e comparabili con questi tre metodi, che conferma che l’attività della sostanza è valido. In alternativa, può essere utile misurare l’espressione di geni chiave e proteine nella melanogenesi in risposta alla sostanza in esame per esaminare l’attività di ipopigmentazione. Oltre alla tirosinasi, proteine tirosinasi (TRP-1) e tautomerase del dopachrome (TRP-2) sono enzimi critici nella melanogenesi8. Il fattore di trascrizione microftalmia-collegata di fattore di trascrizione (MITF) è un regolatore matrice nella melanogenesi e quantificazione dei suoi livelli di espressione di proteina/del gene o un’analisi di attività del promotore è utilizzabile anche per valutare l’attività di ipopigmentazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo presentato i protocolli per la valutazione dell’attività di ipopigmentazione dei composti di prova utilizzando melanociti coltivati. I risultati rappresentativi hanno mostrato l’effetto di ipopigmentazione dell’arbutina, un inibitore della tirosinasi che ha inibito il contenuto di melanina di attività e cellulare di tirosinasi. Questi metodi sono ampiamente usati nella ricerca di attività anti-melanogenic. Usando queste analisi, abbiamo identificato anche con successo parecchi composti bioattivi che hanno mela…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla Korea Institute of Planning e valutazione per la tecnologia in cibo, agricoltura e silvicoltura (IPET) attraverso il programma di sviluppo della tecnologia Agri-Bioindustry, finanziato dalla Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs (MAFRA ) (116159-02-2-WT011) e scuola di Scienze della vita e della biotecnologia per BK21 PLUS, Università della Corea.
Materials
| 3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine | Sigma | D9628 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | #320145 | |
| Arbutin | Fluka | #10960 | |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | |
| FBS | HyClone | SH30084.03 | |
| Formalin | Yakuri Pure Chemicals | #16223 | 37% |
| Gold chloride | American MasterTech | AHG0226 | 0.10% |
| HCl | Samchun chemical | H0255 | |
| KCl | Bio basic Canada Inc. | PB0440 | |
| KH2PO4 | Sigma | #60218 | |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | #3817-01 | |
| NaCl | Duksan pure chemicals | #81 | |
| NaOH | Sigma | 655104 | |
| Nuclear fast red | Merck | 100121 | Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate. |
| Penicillin and streptomycin solution | HyClone | SV30010 | |
| Silver nitrate | Duksan Pure Chemicals | #900 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | J.T. Baker | #3817-01 | |
| Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) | Sigma | S5011 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Duksan Pure Chemicals | #2163 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Bio Basic Canada | TB0196 | |
| Triton X-100 | Union Carbide | T8787 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma | T3824 | 25 KU |
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