כימות של היפופיגמנטציה הפעילות במבחנה
Summary
אנו מתארים שלוש שיטות להערכת הפעילות היפופיגמנטציה של כימיקלים במבחנה: כימות של פעילות tyrosinase 1) סלולר ותוכן 2) מלנין, או 3) מידה של מלנין מאת צביעת תאי המלנין וניתוח התמונה.
Abstract
מחקר זה מציג שיטות מעבדה כימות של היפופיגמנטציה הפעילות במבחנה. מלנין, הפיגמנט העיקרי של מלנוציטים, הוא מסונתז בתגובה מספר גורמים הסלולר וסביבתיים. המלנין מגן על תאי העור מפני נזק אולטרה, אך יש גם פונקציות biophysical הביוכימי. ייצור יתר או הצטברות של מלנין בעור מלנוציטים עלול לגרום לבעיות עור, כגון, כתמים כהים, melasma, שומות ונמשים. לכן, השליטה של melanogenesis עם סוכנים היפופיגמנטציה חשוב אצל אנשים בעלי צרכים רפואיים או קוסמטיים. מלנין הוא מסונתז בעיקר melanosomes של מלנוציטים תהליך ביוכימי מורכב שנקרא melanogenesis, אשר מושפע חיצוני, פנימי גורמים, כגון הורמונים, דלקות, גיל חשיפה אור אולטרה סגול. אנו מתארים שלוש שיטות כדי לקבוע את הפעילות היפופיגמנטציה של כימיקלים או חומרים טבעיים בתוך המלנוציטים: מדידה של פעילות הסלולר 1) tyrosinase ו 2) מלנין תוכן, ו 3) צביעת וכימות מלנין הסלולר עם תמונה ניתוח.
ב- melanogenesis, tyrosinase מזרז את הצעד הגבלת קצב הממירה L-טירוזין לתוך 3,4-dihydroxyphenylalanine (בסדר גמור) ולאחר מכן לתוך dopaquinone. לכן, עיכוב של tyrosinase הוא מנגנון היפופיגמנטציה תפקידים ראשיים. ב מלנוציטים תרבותי, ניתן לכמת פעילות tyrosinase על-ידי הוספת בסדר גמור כמו מצע ומדידת dopaquinone הייצור על ידי ספקטרופוטומטר. Melanogenesis גם נמדד על ידי לכימות התוכן מלנין. השבר תאי המלנין המכילים מופק עם NaOH, מלנין הוא לכמת spectrophotometrically. לבסוף, ניתן לכמת את התוכן מלנין מאת ניתוח תמונות בעקבות פונטנה-מאסון מכתים של מלנין. למרות התוצאות של מבחני במבחנה אלה לא תמיד לשכפל בעור האדם, שיטות אלה נמצאים בשימוש נרחב במחקר melanogenesis, במיוחד כשלב ראשוני לזיהוי פעילות היפופיגמנטציה פוטנציאליים. שיטות אלה יכולים לשמש גם כדי להעריך את פעילות מלנוציט צמיחה, בידול. תוצאות עקביות עם שלוש שיטות שונות לוודא את החוקיות של האפקטים.
Introduction
מלנין תפקיד קריטי, פיזיולוגיה, פתולוגיה, טוקסיקולוגיה של מספר איברים לרבות עור, עיניים, המוח1. התפקידים העיקריים של מלנין תופעות צילום-הקרנה וביוכימי. המלנין סופג אור אינפרא אדום ונראה לעין, כמו גם קרינת אולטרה סגול (UV), עם קליטה מוגברת ממחירים באורכי גל קצרים יותר של אור; לפיכך, מלנין מגן על רקמות מן הנזק שנגרם על ידי האור הנראה או קרינת UV2. מלנין הוא נוגד חמצון, יש זיקה מתכות וכימיקלים רעילים אחרים; לכן, זה באפשרותך להגן על רקמות סטרס חמצוני וכימיים3. עם זאת, ייצור יתר של המלנין גורם בעיות עור.
ובאיכות של מלנין בעור, איריס הן גורמים החשובים ביותר של הצבע של איריס, העור. אנשים אולי יש העדפות צבע עור שונים; כמה טובה לעור שזוף, בעוד אחרים לטובת עור בצבעים בהירים יותר. בהתאם פרופילים אלה הצרכן, מוצרי קוסמטיקה היפופיגמנטציה פותחו כדי לספק שווקים נפרדים עבור העור המועדף צבעים4. בהתאם לכך, מחקרים של היפופיגמנטציה ופעילות אנטי-melanogenic חשובים הן מבחינה מדעית והן מבחינה מעשית.
Melanogenesis הוא תהליך מורכב של מלנין ביוסינטזה דרך סדרה של תגובות כימיות אנזימטי ספונטנית של מלנוציטים. מלנוציט אחד מוקף כ 36 keratinocytes, melanocytes הם המפעלים סינתזת המלנין להפיץ את המוצר שלהם כדי keratinocytes שכנות. העור, המלנין מיוצר ומאוחסן בתא melanosomal של מלנוציטים מועבר keratinocytes שכנות בתוך האפידרמיס ויה דנדריטים.
L-טירוזין משמשת מצע ראשוני עבור melanogenesis ו- tyrosinase את האנזים מזרז שתי תגובות רצופות להמיר L-טירוזין לתוך 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) ולאחר מכן לתוך dopaquinone. תגובות אלו הן הצעד הגבלת קצב ב-5,melanogenesis6. בהתאם לכך, פעילות היפופיגמנטציה קודם נמדד על ידי הערכת הפעילות התאית tyrosinase ישירות. כדי לעשות זאת, תמציות מלנוציט המכיל tyrosinase מודגרת עם DOPA ולא dopaquinone המיוצר הדגימות נמדד על ידי ספקטרופוטומטר-475 ננומטר. הערכים הם מנורמל על ידי ריכוז חלבון של דגימות, וכן חומרים מהתוצאה פעילות היפופיגמנטציה תפקידים במערך dopaquinone פחות בהשוואה עם פקדים.
שנית, ניתן לכמת פעילות היפופיגמנטציה על ידי מדידת מלנין בעור מלנוציטים בתרבית ישירות. לאחר מטפלים תאים עם החומר במבחן, מלנין מופק בתנאים אלקליין, התוכן מלנין הוא לכמת באמצעות ספקטרופוטומטר 400 nm. סוכן היפופיגמנטציה תגרום תוכן מלנין נמוכה יותר מאשר הפקדים7.
לבסוף, ניתן לכמת את הפעילות היפופיגמנטציה על ידי פונטנה-מאסון מלנין מכתים וניתוח תמונות עוקבות. פונטנה-מאסון מכתים, גרגרי המלנין להפחית חנקת אמוניה-הכסף למצב מתכתי שחור גלויה, שחור באזורים של תאים בתמונות מיקרוסקופיים מייצגים את כמות המלנין.
סוכן היפופיגמנטציה בדרך כלל נותן תוצאות דומות בקנה אחד עם שלוש שיטות אלה, שמאשר כי הפעילות של החומר הוא חוקי. לחלופין, זה עשוי להיות שימושי למדוד את הביטוי של גנים מרכזיים, חלבונים ב- melanogenesis בתגובה חומר המבחן לבחון פעילות היפופיגמנטציה. בנוסף tyrosinase, חלבונים הקשורים tyrosinase (TRP-1) dopachrome tautomerase (TRP-2) הם קריטיים לאנזימים melanogenesis8. גורם שעתוק microphthalmia-הקשורים פקטור שעתוק (MITF) הוא הרגולטור הראשי melanogenesis, כימות של רמות ביטוי גנים/חלבון שלה או assay פעילות יזם יכול לשמש גם כדי להעריך את פעילות היפופיגמנטציה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הצגנו פרוטוקולים להערכת הפעילות היפופיגמנטציה של תרכובות בדיקת שימוש בתרבית מלנוציטים. התוצאות נציג הראו את השפעת היפופיגמנטציה יערות, מעכב tyrosinase זה עכבות פעילות tyrosinase ותוכן מלנין הסלולר. שיטות אלה נמצאים בשימוש נרחב במחקר פעילות אנטי-melanogenic. באמצעות מבחני האלה, גם בהצלחה זיהינו מספר תר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קוריאה המכון של תכנון והערכה עבור טכנולוגיית מזון, חקלאות, יערנות (IPET) באמצעות תוכנית פיתוח טכנולוגיה Agri-Bioindustry, ממומן על ידי משרד החקלאות, המזון, לענייני כפרי (MAFRA ) (116159-02-2-WT011), בית הספר למדעי החיים וביוטכנולוגיה BK21 פלוס, אוניברסיטת קוריאה.
Materials
| 3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine | Sigma | D9628 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | #320145 | |
| Arbutin | Fluka | #10960 | |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | |
| FBS | HyClone | SH30084.03 | |
| Formalin | Yakuri Pure Chemicals | #16223 | 37% |
| Gold chloride | American MasterTech | AHG0226 | 0.10% |
| HCl | Samchun chemical | H0255 | |
| KCl | Bio basic Canada Inc. | PB0440 | |
| KH2PO4 | Sigma | #60218 | |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | #3817-01 | |
| NaCl | Duksan pure chemicals | #81 | |
| NaOH | Sigma | 655104 | |
| Nuclear fast red | Merck | 100121 | Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate. |
| Penicillin and streptomycin solution | HyClone | SV30010 | |
| Silver nitrate | Duksan Pure Chemicals | #900 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | J.T. Baker | #3817-01 | |
| Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) | Sigma | S5011 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Duksan Pure Chemicals | #2163 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Bio Basic Canada | TB0196 | |
| Triton X-100 | Union Carbide | T8787 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma | T3824 | 25 KU |
References
- Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells. Pigment Cell & Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Galvan, I., Solano, F. Melanin chemistry and the ecology of stress. Physiological and Biochemical Zoology. 88 (3), 352-355 (2015).
- Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners. Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).
- Cooksey, C. J., et al. Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase. Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).
- Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase. Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).
- Gillbro, J. M., Olsson, M. J. The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents – existing and new approaches. International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).
- Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes. Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).
- Lee, J. H., et al. Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes. Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression. Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).
- Jun, H. J., et al. p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis. European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibition of γ-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism. Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).
- Choi, Y. M., et al. Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes. European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).
- Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes. Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).
- Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation. Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).
- D’Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E. Signaling pathways in melanogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1144 (2016).
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).
- Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. α-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes. Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).
- Hu, D. N. Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).
- Carriel, V. S., et al. A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).
