Quantifizierung der Hypopigmentation Aktivität In Vitro
Summary
Wir beschreiben drei experimentelle Methoden zur Bewertung der Hypopigmentation Aktivität von Chemikalien, die in-vitro-: Quantifizierung der 1) zellulären Tyrosinase-Aktivität und Melanin (2) Inhalt und (3) Messung von Melanin durch zelluläre Melanin Färbung und Bildanalyse.
Abstract
Diese Studie stellt Labormethoden für die Quantifizierung von Hypopigmentierung Aktivität in vitro. Melanin, das große Pigment in Melanozyten, wird als Reaktion auf mehrere zelluläre und umweltbedingten Faktoren synthetisiert. Melanin schützt die Hautzellen vor UV-Schäden, aber auch biophysikalische und biochemische Funktionen hat. Übermäßige Produktion oder Ansammlung von Melanin in den Melanozyten kann dazu führen, dass dermatologische Problemen, wie z. B. Muttermale, Sommersprossen, Pigmentflecken und Melasma. Daher ist die Kontrolle der Melanogenese mit Hypopigmentierung Agenten wichtig bei Patienten mit klinischen oder kosmetische Bedürfnisse. Melanin wird in erster Linie in den Melanosomen Melanozyten in einen komplexen biochemischen Prozess namens Melanogenese, welche von der Erwartungshaltung extrinsischen und intrinsischen Faktoren wie Hormone, Entzündungen, Alter und UV-Licht Exposition synthetisiert. Wir beschreiben drei Methoden zur Bestimmung der Hypopigmentation Aktivität von chemischen oder natürlichen Substanzen in Melanozyten: Messung von (1) zellulären Tyrosinase-Aktivität und Melanin (2) Inhalt und (3) Färbung und Quantifizierung zellulären Melanin mit Bild Analyse.
In Melanogenese katalysiert Tyrosinase die Bandbreitenbegrenzung Schritt, der L-Tyrosin in 3,4-Dihydroxyphenylalanine (l-Dopa) und dann in Dopaquinone umwandelt. Daher ist die Hemmung der Tyrosinase eine primäre Hypopigmentierung Mechanismus. In kultivierten Melanozyten kann Tyrosinase-Aktivität durch Hinzufügen von l-Dopa als Substrat und Messung Dopaquinone Produktion durch Spektralphotometrie quantifiziert werden. Melanogenese kann auch durch Quantifizierung des Melanin Inhalts gemessen werden. Der Melanin-haltigen zelluläre Anteil wird mit NaOH extrahiert und Melanin wird spektrophotometrisch quantifiziert. Zu guter Letzt kann der Melanin Inhalt durch die Bildanalyse nach Fontana-Masson Färbung von Melanin quantifiziert werden. Obwohl die Ergebnisse dieser in-vitro-Untersuchungen nicht immer in der menschlichen Haut reproduziert werden können, sind diese Methoden vor allem als erster Schritt um potenzielle Hypopigmentierung Aktivitäten zu erkennen in der Melanogenese Forschung, verbreitet. Diese Methoden können auch zur Aktivität der Melanozyten, Wachstum und Differenzierung zu bewerten. Die Gültigkeit der Effekte gewährleisten konsistente Ergebnisse mit drei verschiedenen Methoden.
Introduction
Melanin spielt eine entscheidende Rolle in der Physiologie, Pathologie und Toxikologie mehrere Organe einschließlich der Haut, Augen und Gehirn1. Hauptfunktionen von Melanin sind Foto-Screening und biochemischen Wirkungen. Melanin absorbiert Nah-Infrarot- und sichtbares Licht sowie Ultraviolett (UV) Strahlung, mit erhöhten Absorptionsraten bei kürzeren Wellenlängen des Lichts; Melanin schützt somit vor Schäden durch sichtbares Licht oder UV Strahlung2Gewebe. Melanin ist ein Antioxidans und hat eine Affinität für Metalle und andere giftigen Chemikalien; Daher kann es Gewebe vor oxidativen und chemischen Stress3schützen. Allerdings verursacht die übermäßige Produktion von Melanin dermatologische Probleme.
Die Quantität und Qualität von Melanin in der Haut und Iris sind die wichtigsten Determinanten der Farbe der Iris und der Haut. Menschen können unterschiedlicher Hautfarbe Farbvorlieben haben; Einige bevorzugen gebräunten Haut, während andere hellere Hautfarben bevorzugen. Abhängig von diesen Verbraucherprofile entwickelten Hypopigmentierung Kosmetik Einzelmärkte für bevorzugte Haut Farben4zu befriedigen. Dementsprechend sind Studien der Hypopigmentation und Anti-Melanogenic Tätigkeit wichtig, sowohl wissenschaftlich als auch praktisch.
Melanogenese ist der komplexe Prozess der Melanin Biosynthese durch eine Reihe von enzymatischen und spontane chemische Reaktionen in Melanozyten. Eine Melanozyten ist umgeben von ca. 36 Keratinozyten und Melanozyten sind die Melanin-Synthese-Fabriken, die ihr Produkt zu benachbarten Keratinozyten verteilen. In der Haut wird das Melanin produziert und gespeichert in der Melanosomal Fach der Melanozyten zu benachbarten Keratinozyten in die Epidermis über Dendriten transportiert.
L-Tyrosin dient als das ursprüngliche Substrat für Melanogenese und das Enzym Tyrosinase zwei aufeinander folgende Reaktionen katalysiert, die L-Tyrosin in 3,4-Dihydroxyphenylalanine (DOPA) und dann in Dopaquinone umwandeln. Diese Reaktionen sind die Bandbreitenbegrenzung Schritt Melanogenese5,6. Dementsprechend kann Hypopigmentierung Aktivität zuerst durch Beurteilung zellulärer Tyrosinase-Aktivität direkt gemessen werden. Hierzu sind Melanozyten Extrakte mit Tyrosinase mit DOPA inkubiert und die Dopaquinone produziert in den Proben gemessen werden, durch Spektralphotometrie auf 475 nm. Die Werte werden durch die Proteinkonzentrationen der Proben und Stoffe mit Hypopigmentierung Aktivität führen zu weniger Dopaquinone Bildung im Vergleich zu Kontrollen normalisiert.
Zweitens kann Hypopigmentierung Aktivität durch Messung von Melanin in kultivierten Melanozyten direkt quantifiziert werden. Nach der Behandlung der Zellen mit dem Testmaterial, Melanin unter alkalischen Bedingungen gewonnen wird und der Melanin Inhalt wird quantifiziert durch Spektralphotometrie bei 400 nm. Ein Hypopigmentierung Agent führt zu einem niedrigeren Gehalt an Melanin als die Kontrollen-7.
Schließlich kann die Hypopigmentation Aktivität mit Fontana-Masson Melanin Färbung und anschließende Bildanalyse quantifiziert werden. In der Fontana-Masson Färbung, Melanin Granulat Ammoniak-Silbernitrat auf einen sichtbaren schwarzen metallischen Zustand reduzieren und die schwarzen Bereiche von Zellen in mikroskopische Aufnahmen repräsentieren die Menge an Melanin.
Ein Hypopigmentierung Agent gibt in der Regel einheitliche und vergleichbare Ergebnisse mit diesen drei Methoden, die bestätigt, dass die Aktivität des Stoffes gültig ist. Alternativ kann es nützlich, um den Ausdruck von wichtigen Genen und Proteinen in Melanogenese in Beantwortung einer Prüfsubstanz Hypopigmentierung Aktivität untersuchen zu messen sein. Wichtige Enzyme in Melanogenese8sind neben Tyrosinase Tyrosinase-related Proteine (TRP-1) und Dopachrome Tautomerase (TRP-2). Die Transkription Faktor Mikrophthalmie-assoziierter Transkriptionsfaktor (MITF) ist ein master Regulator Melanogenese und Quantifizierung von seiner gen/Proteingehalte Ausdruck oder ein Promotor-Aktivität-Assay kann auch zur Hypopigmentierung Tätigkeit zu beurteilen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir präsentierten Protokolle für die Bewertung der Hypopigmentation Aktivität der Testverbindungen mit kultivierten Melanozyten. Die repräsentativen Ergebnisse zeigten die Hypopigmentation Wirkung von Arbutin, ein Tyrosinase-Inhibitoren, die Tyrosinase-Aktivität und zellulären Melanin Inhalt gehemmt. Diese Methoden sind in der Anti-Melanogenic Aktivität Forschung verbreitet. Mit diesen Tests, haben wir auch erfolgreich identifiziert mehrere bioaktive Substanzen, die Melanogenese hemmende Effekte auf B16F10 Zellen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Korea Institute of Planning und Bewertung für Technologie in der Ernährung, Landwirtschaft und Forstwirtschaft (IPET) durch das Agri-Bioindustrie Technology Development Program, finanziert von der Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs (MAFRA unterstützt. ) (116159-02-2-WT011) und Hochschule für Life Sciences und Biotechnologie für BK21 PLUS, Korea University.
Materials
| 3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine | Sigma | D9628 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | #320145 | |
| Arbutin | Fluka | #10960 | |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | |
| FBS | HyClone | SH30084.03 | |
| Formalin | Yakuri Pure Chemicals | #16223 | 37% |
| Gold chloride | American MasterTech | AHG0226 | 0.10% |
| HCl | Samchun chemical | H0255 | |
| KCl | Bio basic Canada Inc. | PB0440 | |
| KH2PO4 | Sigma | #60218 | |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | #3817-01 | |
| NaCl | Duksan pure chemicals | #81 | |
| NaOH | Sigma | 655104 | |
| Nuclear fast red | Merck | 100121 | Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate. |
| Penicillin and streptomycin solution | HyClone | SV30010 | |
| Silver nitrate | Duksan Pure Chemicals | #900 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | J.T. Baker | #3817-01 | |
| Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) | Sigma | S5011 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Duksan Pure Chemicals | #2163 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Bio Basic Canada | TB0196 | |
| Triton X-100 | Union Carbide | T8787 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma | T3824 | 25 KU |
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