Quantification de l’activité In Vitro de l’Hypopigmentation
Summary
Nous décrivons trois méthodes expérimentales pour l’évaluation de l’activité de l’hypopigmentation des produits chimiques in vitro : quantification du contenu de l’activité et la mélanine 2) tyrosinase 1) cellulaire et 3) mesure de mélanine de mélanine cellulaire coloration et analyse d’images.
Abstract
Cette étude présente les méthodes de laboratoire pour la quantification de l’hypopigmentation activité in vitro. La mélanine, le pigment majeur dans les mélanocytes, est synthétisée en réponse à de multiples facteurs cellulaires et de l’environnementales. La mélanine protège les cellules de la peau contre les dommages UV, mais a aussi des fonctions biochimiques et biophysiques. Production excessive ou l’accumulation de mélanine dans les mélanocytes peut causer des problèmes dermatologiques, comme les taches de rousseur, taches brunes, mélasma et taupes. Donc, le contrôle de la mélanogenèse avec des agents de l’hypopigmentation est important chez les personnes nécessitant des soins cliniques ou cosmétiques. La mélanine est principalement synthétisée dans les mélanosomes de mélanocytes dans un processus biochimique complexe appelé mélanogénèse, qui est influencé par extrinsèque et facteurs intrinsèques, tels que les hormones, l’inflammation, l’âge et exposition à la lumière ultraviolette. Nous décrivons trois méthodes permettant de déterminer l’activité de l’hypopigmentation de produits chimiques ou des substances naturelles dans les mélanocytes : mesure de l’activité de la tyrosinase 1) cellulaires et teneur en mélanine 2) 3) coloration et quantification mélanine cellulaire avec image analyse.
Dans la mélanogénèse, tyrosinase catalyse l’étape cinétiquement limitante qui convertit la L-tyrosine en 3, 4-dihydroxyphénylalanine (L-DOPA), puis en dopaquinone. Par conséquent, l’inhibition de la tyrosinase est un mécanisme primaire d’hypopigmentation. Les mélanocytes, activité de la tyrosinase peut être quantifiée en ajoutant la L-DOPA comme substrat et en mesurant la dopaquinone production par spectrophotométrie. Mélanogénèse peut également être mesurée en quantifiant la teneur en mélanine. La fraction cellulaire contenant de la mélanine est extraite avec NaOH et la mélanine est quantifiée par spectrophotométrie. Enfin, la teneur en mélanine peut être quantifiée par analyse d’image après coloration de Fontana-Masson de la mélanine. Bien que les résultats de ces essais in vitro ne peuvent pas toujours être reproduits dans la peau humaine, ces méthodes sont largement utilisés dans la recherche de la mélanogénèse, surtout comme l’étape initiale pour identifier l’activité potentielle de l’hypopigmentation. Ces méthodes permettent également d’évaluer la différenciation, la croissance et l’activité des mélanocytes. Des résultats cohérents avec les trois différentes méthodes assurer la validité des effets.
Introduction
Mélanine joue un rôle essentiel dans la physiologie, la pathologie et toxicologie de plusieurs organes, y compris la peau, des yeux et cerveau1. Principales fonctions de mélanine sont effets photo-dépistage et biochimiques. La mélanine absorbe la lumière visible et proche infrarouge ainsi que des rayonnements ultraviolets (UV), avec des taux d’absorption accrue de courtes longueurs d’onde de la lumière ; ainsi, la mélanine protège les tissus contre les dommages causés par la lumière visible ou UV radiation2. La mélanine est un antioxydant et a une affinité pour les métaux et autres produits chimiques toxiques ; par conséquent, il peut protéger des tissus du stress oxydatif et chimiques3. Cependant, la production excessive de mélanine entraîne des problèmes dermatologiques.
La quantité et la qualité de la mélanine dans la peau et les iris sont les déterminants les plus importants de la couleur de l’iris et la peau. Personnes peuvent avoir des préférences de couleur de peau différente ; certains favorisent la peau bronzée, tandis que d’autres favorisent les couleurs de peau plus légères. Selon ces profils de consommateurs, une hypopigmentation cosmétiques ont été développés pour satisfaire les marchés individuels pour peau favorisée couleurs4. En conséquence, études d’activité hypopigmentation et anti-mélanogenèse sont importantes tant scientifiquement que pratiquement.
Mélanogénèse est le complex processus de biosynthèse de la mélanine par une série de réactions chimiques enzymatiques et spontanées dans les mélanocytes. Un mélanocyte est entouré d’environ 36 kératinocytes et mélanocytes sont les usines de synthèse de la mélanine qui distribuent leurs produits aux kératinocytes voisins. Dans la peau, la mélanine produite et stockée dans le compartiment de melanosomal de mélanocytes est transportée vers les kératinocytes voisins dans l’épiderme via dendrites.
L-Tyrosine sert de substrat initial pour la mélanogénèse et l’enzyme tyrosinase catalyse deux réactions consécutives qui convertissent la L-tyrosine en 3, 4-dihydroxyphénylalanine (DOPA), puis en dopaquinone. Ces réactions sont l’étape cinétiquement limitante dans la mélanogénèse5,6. En conséquence, une hypopigmentation activité peut tout d’abord être mesurée en évaluant l’activité de la tyrosinase cellulaire directement. Pour ce faire, des extraits de mélanocytes contenant la tyrosinase sont incubés avec DOPA et la dopaquinone produite dans les échantillons peut être mesurée par spectrophotométrie à 475 nm. Les valeurs sont normalisées par les concentrations de protéines des échantillons et les substances ayant une hypopigmentation activité donnent lieu à moins dopaquinone formation comparée aux témoins.
Deuxièmement, une hypopigmentation activité peut être quantifiée en mesurant la mélanine dans les mélanocytes cultivés directement. Après le traitement des cellules avec la substance d’essai, la mélanine est extraite dans des conditions alcalines et de la teneur en mélanine est quantifiée par spectrophotométrie à 400 nm. Un agent de l’hypopigmentation se traduira par une plus faible teneur de mélanine que les contrôles7.
Enfin, l’activité de l’hypopigmentation peut être quantifiée par la coloration de la mélanine de Fontana-Masson et analyse d’images ultérieures. Coloration de Fontana-Masson, granules de mélanine réduisent le nitrate d’ammoniaque et d’argent à un état métallique noir visible et les zones noires de cellules dans des images microscopiques représentent la quantité de mélanine.
Un agent de l’hypopigmentation donne généralement des résultats cohérents et comparables avec ces trois méthodes, qui confirme que l’activité de la substance est valide. Alternativement, il peut être utile de mesurer l’expression des gènes clés et des protéines dans la mélanogénèse en réponse à une substance d’essai pour examiner l’activité hypopigmentation. En plus de la tyrosinase, protéines tyrosinase (TRP-1) et tautomerase tautomèrase (TRP-2) sont des enzymes critiques dans la mélanogénèse8. Le facteur de transcription associée à une microphtalmie de facteur de transcription (MITF) est un maître régulateur dans la mélanogénèse et la quantification des niveaux d’expression de ses gènes/protéines ou un dosage de l’activité du promoteur permet également d’évaluer l’activité hypopigmentation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons présenté des protocoles d’évaluation de l’activité de l’hypopigmentation des composés d’essai à l’aide de mélanocytes cultivés. Les résultats représentatifs ont montré l’effet de l’hypopigmentation de l’arbutine, un inhibiteur de la tyrosinase qui inhibe la tyrosinase activité et cellulaires mélanine contenu. Ces méthodes sont largement utilisées dans la recherche de l’activité anti-mélanogénique. À l’aide de ces tests, nous avons identifié avec succès plusieurs compos?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l’Institut de planification de la Corée et l’évaluation des technologies en alimentation, Agriculture et foresterie (IPET) du programme de développement de technologie Agri-bio-industrie, financé par le ministère de l’Agriculture, alimentation et affaires rurales (MAFRA ) (116159-02-2-WT011) et l’école des Sciences de la vie et la biotechnologie pendant PLUS de BK21, Université de Corée.
Materials
| 3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine | Sigma | D9628 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | #320145 | |
| Arbutin | Fluka | #10960 | |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | |
| FBS | HyClone | SH30084.03 | |
| Formalin | Yakuri Pure Chemicals | #16223 | 37% |
| Gold chloride | American MasterTech | AHG0226 | 0.10% |
| HCl | Samchun chemical | H0255 | |
| KCl | Bio basic Canada Inc. | PB0440 | |
| KH2PO4 | Sigma | #60218 | |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | #3817-01 | |
| NaCl | Duksan pure chemicals | #81 | |
| NaOH | Sigma | 655104 | |
| Nuclear fast red | Merck | 100121 | Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate. |
| Penicillin and streptomycin solution | HyClone | SV30010 | |
| Silver nitrate | Duksan Pure Chemicals | #900 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | J.T. Baker | #3817-01 | |
| Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) | Sigma | S5011 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Duksan Pure Chemicals | #2163 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Bio Basic Canada | TB0196 | |
| Triton X-100 | Union Carbide | T8787 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma | T3824 | 25 KU |
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