Kwantificering van hypopigmentatie activiteit In Vitro
Summary
We beschrijven drie experimentele methoden voor de evaluatie van de activiteit van de verdikking van chemische stoffen in vitro: kwantificering van 1) cellulaire tyrosinase-activiteit en 2) melanine inhoud, en 3) meting van melanine door cellulaire melanine kleuring en beeld-analyse.
Abstract
Deze studie presenteert laboratoriumtechnieken voor de kwantificering van hypopigmentatie activiteit in vitro. Melanine, de grote pigment in de melanocyten, wordt gesynthetiseerd in reactie op meerdere factoren voor cellulaire en milieu. Melanine beschermt de huidcellen tegen ultraviolet schade, maar heeft ook biofysische en biochemische functies. Buitensporige productie of ophoping van melanine in de melanocyten kan leiden tot dermatologische problemen, zoals sproeten, donkere vlekken, melasma en mollen. Daarom is de controle van melanogenesis met hypopigmentatie agenten is belangrijk bij personen met klinische en cosmetische behoeften. Melanine is hoofdzakelijk gesynthetiseerd in de melanosomes van melanocyten in een complexe biochemische proces genaamd melanogenesis, die wordt beïnvloed door Extrinsieke en intrinsieke factoren, zoals hormonen, ontsteking, leeftijd en blootstelling aan ultraviolet licht. We beschrijven drie methoden om te bepalen van de activiteit van de verdikking van chemicaliën of natuurlijke stoffen in de melanocyten: meting van de 1) cellulaire tyrosinase-activiteit 2) melanine inhoud, en 3) kleuring en kwantificering cellulaire melanine met afbeelding analyse.
In melanogenesis katalyseert tyrosinase de snelheidslimieten stap dat L-tyrosine naar 3,4-dihydroxyphenylalanine (levodopa) en vervolgens naar dopaquinone converteert. Daarom is de remming van tyrosinase een primaire hypopigmentatie mechanisme. In gekweekte melanocyten, kan tyrosinase-activiteit worden gekwantificeerd door levodopa als een substraat toe te voegen en het meten van de dopaquinone productie door spectrofotometrie. Melanogenesis kan ook worden gemeten door het kwantificeren van de melanine inhoud. De melanine bevattende cellulaire fractie wordt geëxtraheerd met NaOH en melanine spectrophotometrically wordt gekwantificeerd. Tot slot kan de melanine inhoud worden gekwantificeerd door beeldanalyse na Fontana-Masson kleuring van melanine. Hoewel de resultaten van deze in-vitrotests kunnen niet altijd worden gereproduceerd in de menselijke huid, worden deze methoden veel gebruikt in melanogenesis onderzoek, met name als de eerste stap om te identificeren van potentiële hypopigmentatie activiteit. Deze methoden kunnen ook worden gebruikt ter beoordeling van de melanocyt activiteit, groei en differentiatie. Consistente resultaten met de drie verschillende methoden zorgen de geldigheid van de effecten.
Introduction
Melanine speelt een cruciale rol in de fysiologie, pathologie en toxicologie van verscheidene organen waaronder de huid, ogen en hersenen1. Belangrijkste functies van melanine zijn foto-screening en biochemische effecten. Melanine absorbeert nabij-infrarood en zichtbaar licht, alsmede ultraviolette (UV) straling, met verhoogde absorptie tarieven bij kortere golflengten van het licht; melanine beschermt dus weefsels tegen schade veroorzaakt door zichtbaar licht of UV straling2. Melanine is een antioxidant en heeft een affiniteit voor metalen en andere giftige chemische stoffen; het kan daarom weefsels beschermen tegen oxidatieve en chemische stress3. De overmatige productie van melanine veroorzaakt echter dermatologische problemen.
De kwantiteit en kwaliteit van melanine in de huid en iris zijn de belangrijkste determinanten van de kleur van de iris en de huid. Individuen kunnen hebben verschillende huid kleurvoorkeuren; enkele gunst gebruinde huid, terwijl anderen het voordeel van lichtere kleuren van de huid. Afhankelijk van deze consument profielen, zijn hypopigmentatie cosmetica ontwikkeld om te voldoen aan individuele markten voor favoriete huid kleuren4. Dienovereenkomstig, zijn studies van hypopigmentatie en anti-melanogenic activiteiten belangrijk, zowel wetenschappelijk als praktisch.
Melanogenesis is het complexe proces van melanine biosynthese door middel van een reeks van enzymatische en spontane chemische reacties in de melanocyten. Een melanocyt wordt omgeven door ongeveer 36 keratinocyten en melanocyten zijn de melanine synthese fabrieken die verspreiden van hun product aan naburige keratinocyten. In de huid, wordt de melanine geproduceerd en opgeslagen in het compartiment van de melanosomal van melanocyten getransporteerd naar naburige keratinocyten in de opperhuid via dendrites.
L-Tyrosine serveert de eerste substraat voor melanogenesis en het enzym tyrosinase katalyseert twee opeenvolgende reacties die L-tyrosine naar 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) en vervolgens naar dopaquinone converteren. Deze reacties zijn de snelheidslimieten stap in melanogenesis5,6. Dienovereenkomstig, hypopigmentatie activiteit kan eerst worden gemeten door cellulaire tyrosinase-activiteit rechtstreeks te bepalen. Om dit te doen, melanocyt extracten met tyrosinase worden geïncubeerd met DOPA en de dopaquinone geproduceerd in de monsters kan worden gemeten door spectrofotometrie op 475 nm. De waarden zijn genormaliseerd door de concentraties van de eiwitten van de monsters, alsmede stoffen met hypopigmentatie activiteit resultaat in minder vorming van de dopaquinone vergeleken met besturingselementen.
Ten tweede, hypopigmentatie activiteit kan worden gekwantificeerd door het meten van melanine in gekweekte melanocyten direct. Na behandeling van cellen met het testmateriaal, melanine wordt gewonnen onder alkalische omstandigheden en de melanine inhoud wordt gekwantificeerd door spectrofotometrie bij 400 nm. Een verdikking agent zal resulteren in een lagere melanine inhoud dan de besturingselementen7.
Tot slot, de verdikking activiteit kan worden gekwantificeerd door Fontana-Masson melanine kleuring en latere beeldanalyse. Melanine korrels Verlaag ammoniak-zilvernitraat aan een zwarte metalen zichtbaarheidsstatus in Fontana-Masson kleuring, en de zwarte gebieden van cellen in de microscopische beelden vertegenwoordigen de hoeveelheid melanine.
Een verdikking agent geeft meestal consistente en vergelijkbare resultaten met deze drie methoden, die bevestigt dat de activiteit van de stof geldig is. Anderzijds kan het zinvol zijn om te meten de uitdrukking van essentiële genen en proteïnen in melanogenesis naar aanleiding van een teststof te onderzoeken van hypopigmentatie activiteit. Naast tyrosinase zijn tyrosinase-gerelateerde eiwitten (TRP-1) en dopachrome tautomerase (TRP-2) essentiële enzymen in melanogenesis8. De transcriptie factor microphthalmia-geassocieerde transcriptiefactor (MITF) is een meester regelgever in melanogenesis en kwantificering van de gene/proteïne expressie niveaus of een promotor activiteit assay kan ook worden gebruikt om te beoordelen van hypopigmentatie activiteit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wij presenteerden protocollen voor de beoordeling van de activiteit van de verdikking van de test verbindingen met behulp van gekweekte melanocyten. De representatieve resultaten toonde het effect van de verdikking van de Arbutine, een tyrosinase-remmer die geremd tyrosinase-activiteit en cellulaire melanine inhoud. Deze methoden worden veel gebruikt in anti-melanogenic activiteit onderzoek. Met behulp van deze tests, hebben we ook met succes verschillende bioactieve stoffen die melanogenesis remmende effecten op B16F10 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Korea Instituut voor Planning en evaluatie voor technologie in voedsel, landbouw en bosbouw (IPET) via de Agri-dierziekte Technology Development Program, gefinancierd door het ministerie van landbouw, voedsel en plattelandsontwikkeling zaken (MAFRA ) (116159-02-2-WT011) en de School van de biowetenschappen en de biotechnologie voor BK21 PLUS, Universiteit van Korea.
Materials
| 3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine | Sigma | D9628 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | #320145 | |
| Arbutin | Fluka | #10960 | |
| DMEM | HyClone | SH30243.01 | |
| FBS | HyClone | SH30084.03 | |
| Formalin | Yakuri Pure Chemicals | #16223 | 37% |
| Gold chloride | American MasterTech | AHG0226 | 0.10% |
| HCl | Samchun chemical | H0255 | |
| KCl | Bio basic Canada Inc. | PB0440 | |
| KH2PO4 | Sigma | #60218 | |
| Na2HPO4 | J.T.Baker | #3817-01 | |
| NaCl | Duksan pure chemicals | #81 | |
| NaOH | Sigma | 655104 | |
| Nuclear fast red | Merck | 100121 | Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate. |
| Penicillin and streptomycin solution | HyClone | SV30010 | |
| Silver nitrate | Duksan Pure Chemicals | #900 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | J.T. Baker | #3817-01 | |
| Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4) | Sigma | S5011 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Duksan Pure Chemicals | #2163 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Bio Basic Canada | TB0196 | |
| Triton X-100 | Union Carbide | T8787 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma | T3824 | 25 KU |
References
- Bonaventure, J., Domingues, M. J., Larue, L. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of melanocytes and melanoma cells. Pigment Cell & Melanoma Research. 26 (3), 316-325 (2013).
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Galvan, I., Solano, F. Melanin chemistry and the ecology of stress. Physiological and Biochemical Zoology. 88 (3), 352-355 (2015).
- Burger, P., Landreau, A., Azoulay, S., Michel, T., Fernandez, X. Skin whitening cosmetics: Feedback and challenges in the development of natural skin lighteners. Cosmetics. 3 (4), 36 (2016).
- Cooksey, C. J., et al. Evidence of the indirect formation of the catecholic intermediate substrate responsible for the autoactivation kinetics of tyrosinase. Journal of Biological Chemistry. 272 (42), 26226-26235 (1997).
- Ando, H., Kondoh, H., Ichihashi, M., Hearing, V. J. Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase. Journal of Investigative Dermatology. 127 (4), 751-761 (2007).
- Gillbro, J. M., Olsson, M. J. The melanogenesis and mechanisms of skin-lightening agents – existing and new approaches. International Journal of Cosmetic Science. 33 (3), 210-221 (2011).
- Passeron, T., Coelho, S. G., Miyamura, Y., Takahashi, K., Hearing, V. J. Immunohistochemistry and in situ hybridization in the study of human skin melanocytes. Experimental Dermatology. 16 (3), 162-170 (2007).
- Lee, J. H., et al. Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression in melanocytes. Biotechnology Letters. 34 (5), 805-812 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibitions of lemon balm (Melissa officinalis) ethanolic extract on melanogenesis in B16-F1 murine melanocytes: inhibition of tyrosinase activity and its gene expression. Food Science and Biotechnology. 20 (4), 1051-1059 (2011).
- Jun, H. J., et al. p-Coumaric acid inhibition of CREB phosphorylation reduces cellular melanogenesis. European Food Research and Technology. 235 (6), 1207-1211 (2012).
- Jun, H. J., et al. Dual inhibition of γ-oryzanol on cellular melanogenesis: inhibition of tyrosinase activity and reduction of melanogenic gene expression by a protein kinase a-dependent mechanism. Journal of Natural Products. 75 (10), 1706-1711 (2012).
- Choi, Y. M., et al. Effects of the isoflavone puerarin and its glycosides on melanogenesis in B16 melanocytes. European Food Research and Technology. 231 (1), 75-83 (2010).
- Cho, B. R., Jun, H. J., Thach, T. T., Wu, C., Lee, S. J. Betaine reduces cellular melanin content via suppression of microphthalmia-associated transcription factor in B16-F1 murine melanocytes. Food Science and Biotechnology. 26 (5), 1391-1397 (2017).
- Overwijk, W. W., Restifo, N. P. B16 as a mouse model for human melanoma. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Virador, V. M., Kobayashi, N., Matsunaga, J., Hearing, V. J. A standardized protocol for assessing regulators of pigmentation. Analytical Biochemistry. 270 (2), 207-219 (1999).
- D’Mello, S. A. N., Finlay, G. J., Baguley, B. C., Askarian-Amiri, M. E. Signaling pathways in melanogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1144 (2016).
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127 (24), 5379-5389 (2000).
- Hedley, S. J., Gawkrodger, D. J., Weetman, A. P., MacNeil, S. α-MSH and melanogenesis in normal human adult melanocytes. Pigment Cell Research. 11 (1), 45-56 (1998).
- Hu, D. N. Methodology for evaluation of melanin content and production of pigment cells in vitro. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 645-649 (2008).
- Carriel, V. S., et al. A novel histochemical method for a simultaneous staining of melanin and collagen fibers. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (3), 270-277 (2011).
