JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Partiye Hazırlık bir ölçekte triterpen üretim için geçici Nicotiana Benthamiana ifadede bırakır

Published: August 16, 2018
doi:
10.3791/58169
, , ,
1John Innes Centre

Summary

Geçici Contegra ifade Nicotiana benthamiana yaprakları biyosentetik enzimlerin 2,3-oxidosqualene yeni yüksek değerli triterpen ürünleri doğru endojen malzemeleri yönlendirebilirsiniz. Burada olduğunu hızlı (5 gün) hazırlık-ölçekli üretim triterpeneler ve bu güçlü bitki tabanlı platformu kullanan analogları için detaylı bir protokol açıklanan.

Abstract

Triterpeneler en büyük ve bitki doğal ürünlerin çoğu yapısal olarak farklı aileler vardır. Birçok triterpen türevleri medicinally ilgili biyolojik aktivitesi sahip gösterilmiştir. Ancak, şu ana kadar bu potansiyeli triterpen türevi ilaçlar klinikte bir bolluk içine çevrilmiş olmayışıdır. Belki bu (en azından kısmen) sınırlı pratik sentetik erişim için bu sınıfa bileşik bir sonucu yapısı-etkinlik ilişkiler keşif ve gelişimi bastırmak bir sorun kurşun, adaylar tarafından geleneksel tıbbi Kimya iş akışları. Onların büyük çeşitlilik rağmen triterpeneler tüm tek bir doğrusal habercisi türetilmiştir 2,3-oxidosqualene. İ. benthamiana biyosentetik enzimlerin geçici Contegra ifade 2,3-oxidosqualene, doğal olarak bu ana makine tarafından üretilen değil yeni yüksek değerli triterpen ürünlerin üretimi doğru endojen malzemeleri yönlendirebilirsiniz. Agro-infiltrasyon geçici i. benthamianaifadede ulaşmada etkin ve basit bir yoludur. İşlem bitki yaprakları infiltrasyonu Agrobacterium tumefaciens ilgi ifade construct(s) taşıyan bir süspansiyon ile içerir. Ortak bir ek A. tumefaciens infiltrasyonu zorlanma habercisi kaynağı önemli ölçüde artırır bir enzim artar bir ifade yapısı kodlama verimleri taşıyan. Beş günlük bir süre sonra infiltre yaprak malzeme hasat ve elde etmek ve elde edilen triterpen ürün (ler) izole işlenebilir. Bu yalnızca denemede kullanılan bitkiler sayısını artırarak ölçeklenebilir, güvenilir ve sürekli bir süreçtir. Burada olan bu bitki tabanlı platformu kullanan triterpeneler hızlı hazırlık-ölçekli üretim için bir protokol açıklanan. Protokol dört bitkiler, bitkiler yüzlerce batch-wise infiltrasyon kısa bir süre içinde etkinleştirme aynı anda infiltrasyonu sağlar bir kolayca yinelenebilir vakum infiltrasyon aparat kullanır.

Introduction

Triterpeneler en büyük ve bitki doğal ürünlerin çoğu yapısal olarak farklı aileler vardır. Onların büyük çeşitlilik rağmen tüm triterpen doğal ürünler aynı doğrusal habercisi 2,3-oxidosqualene, bitkilerde mevalonate yolun bir ürün türetilen inanılıyor. 2,3-oxidosqualene cyclization başlatılan ve bir aile oxidosqualene cyclases (OSCs) olarak adlandırılan enzimler tarafından kontrol edilir. Bu cyclization adım doğa1‘ den bildirilen farklı triterpen iskele yüzlerce çeşitlendirme, ilk düzeyini temsil eder. Bu iskele daha da dahil ancak bununla sınırlı olmamak üzere, sitokrom p450s (CYP450s)1,2enzimler uyarlayarak çeşitlendirilmiş. Biyosentetik böyle yolları bazen üst triterpen zar zor tanınabilir olan son ürünleri sonuçlanan büyük karmaşıklık yol açabilir. Örneğin, güçlü böcek ve antifeedant limonoid azadirachtin karmaşık yapısını tirucallane tür3bir tetracyclic triterpen türetmek için inanılır.

Birçok triterpen elde edilen doğal ürünler, nispeten değiştirilmemiş üst iskele, hatta olanlar medicinally ilgili biyolojik etkinlik4,5,6,7sahip gösterilmiştir. Ancak, şu ana kadar bu potansiyeli triterpen türevi ilaçlar klinikte bir bolluk içine çevrilmiş olmayışıdır. Belki bu (en azından kısmen) sınırlı pratik sentetik erişim için bu sınıfa bileşik bir sonucu yapısı-etkinlik ilişkiler keşif ve gelişimi bastırmak bir sorun kurşun, adaylar tarafından geleneksel tıbbi Kimya iş akışları.

İ. benthamiana yaprakları diğer bitki tür triterpen biyosentetik enzimlerin geçici ifade 2,3-oxidosqualene yeni yüksek değerli triterpen ürünleri (Şekil 1) doğru endojen malzemeleri yönlendirebilirsiniz. Bu işlem işlevsel olarak karakterize aday enzimler ve önemli doğal olarak meydana gelen metabolitleri biyosentetik yolları yeniden oluşturmak için kullanılabilir. Aynı şekilde, o da birleşimsel biyosentetik yaklaşımlar roman triterpen ürünler, yapısal olarak ilgili analogları, sistematik araştırma yapısı-aktivite ilişkileri izin kitaplıklarda neden olabilir bir strateji üretmek için yararlanılabilir 8,9biyolojik olarak aktif kurşun bileşikleri.

Agroinfiltration i. benthamiana yaprakları geçici ifade ulaşmada etkin ve basit bir yoludur. İşlem yaprakları infiltrasyonu ile ikili ifade construct(s) ilgi taşıyan A. tumefaciens süspansiyon içerir. Bu hücreler arası uzayda Hava yerinden ve eski yerine koymak o ile A. tumefaciens süspansiyon stoma bantlı yoluyla sıvı zorlar basınç uygulanması yoluyla elde edilir. Bakteri ilgili T-DNA’lar bitki hücrelerinin infiltre yaprak doku ifadede yerelleştirilmiş ve geçici protein sonuçlanan iç transfer.

Transgenik bitkiler üretme geçici ifade için istihdam için herhangi bir ikili vektör uygun biz börülce mozaik virüsü CPMV elde edilen Hypertranslational (HT) protein ifade sistem10, kullanmak 11. bu sistemde faiz gen çevrilmeyen bölgeler (UTR) CPMV RNA-2 üzerinden tarafından çevrili olduğunu. 5′ UTR viral çoğaltma12üzerinde hiçbir güven ile protein çeviri çok yüksek düzeyde kaynaklanan değişiklikler içerir. Bu teknik siteye özgü rekombinasyon Protokolü uyumlu yapıları (pEAQ –HT– DEST)10,11klonlama içerir kolay ve hızlı (pEAQ) ikili vektör serisi geliştirilmiştir. Çoğu pEAQ vektörler de bir domates gür dublör virüs kaynaklı P19 silencing baskılayıcı gen13 ayrı bir P19 taşıyan yük coinfiltrate gerek kaçınmanızı sağlar ve çok affords ifade kaset T-DNA bölümü içinde içerir üst düzey protein ifade ana bitki hücre10,11.

İ. benthamiana bir ifade ana bitki biyosentetik yolları ile çalışırken belirli avantajları olduğu gibi kullanın. Hücre mimarisi özünde uygun mRNA ve protein işleme ve ek olarak gerekli Co enzim, redüktaz (için CYP450s) ve metabolik değişimler haiz uygun bölmelere destekler. Fotosentez karbon kaynağıdır; Böylece, bitkiler sadece kaliteli kompost, sadece su, CO2 (havadan) ve güneş ışığı girişleri gerektiren içinde yetiştirilen olabilir. Bu uysalca büyük multigene ifade oluşturmak gerek inkâr A. tumefaciens, farklı suşları Co infiltrasyonu tarafından elde edilebilir gibi platform da son derece farklı kombinasyonlar proteinlerin, ortak ifade için uygundur kaset. Ayrıca, süreç sürekli ve güvenilir bir şekilde yalnızca denemede kullanılan bitkiler sayısını artırarak ölçeklendirilebilir.

Önceki bizim laboratuvar çalışmalarında yardımcı programı bu platformun partiye hazırlık ölçekli deneyler için göstermiştir. Bu roman triterpeneler hazırlık bioactivity deneyleri ve ölçek için kadar izole ürün gram miktarda elde etmek için dahil. Ayrıca, hànzú triterpen ürünlerin birikimi arttı birkaç bir redüktaz (tHMGR), hızı sınırlaması bir N-terminal-kesme, geribildirim-duyarlı şeklinde 3-hidroksi, 3-methyglutary-koenzim ortak ifade tarafından katlayın ters yönde enzim mevalonate yolu8.

Yetenek kolayca yukarı ölçekli infiltrasyon işlemi tür hazırlık ölçekli deneyler anahtarıdır. Tipik bir deneyde, onlarca yüzlerce bitkilerin izole ürünün hedef miktarını elde etmek için gerekli olabilir. Tek tek yaprakları elle infiltre (gereksiz kullanarak) operasyonel zorlu ve genellikle çok zaman alıcı, bu yöntem rutin ölçek-up için pratik oluşturma. Operatör beceri seviyesine bağlı değildir ve yaprak yüzeyinde daha büyük bir alanı infiltrasyonu sağlar gibi vakum infiltrasyon el infiltrasyon, avantaj sunar. Bu yordam ticari ilaç proteinler14büyük ölçekli üretim için kullanılır. Bu iletişim kuralı piyasada bulunan parçalar inşa edilebilir bir kolayca yinelenebilir vakum infiltrasyon aparat kullanır. Bu 4 bitkiler, hızlı ve pratik batch-wise infiltrasyonu bitkiler yüzlerce kısa bir süre içinde saglayan eşzamanlı infiltrasyonu sağlar (Şekil 2a -2b). Vakum infiltrasyon aparatı infiltrasyon odası (Şekil 2f) formları bir vakum fırından oluşur. Fırın bir pompa vakum su deposu üzerinden bağlanır. Bu büyük ölçüde infiltrasyon odası istenen boşlukta ulaşmak için gereken süreyi azaltır. Bitki bir ısmarlama sahibi güvenli ve A. tumefaciens süspansiyon ile dolu bir 10 L paslanmaz çelik su banyosu içine ters (Şekil 2a -2 c). Bitkiler hava parçaların komple daldırma için verimli infiltrasyon önemlidir. Su banyosu sonra infiltrasyon odası içinde yerleştirilir (Şekil 2B -2e) ve hava yaprak interstisyel alanlarda dışarı çekmek için uygulanan vakum. Basınç 880 mbar (yaklaşık 1 dakika sürer bir işlem) tarafından düşürülmüştür bir kez infiltrasyon odası hızlı bir şekilde geri atmosfer basıncı getirdi bunun üzerine sızma tamamlandıktan fırın giriş vana açarak 20-30 s.

Beş gün sonra infiltrasyon bitki materyali toplama ve sonraki çıkarma ve izole edilmesi istenen ürün (ler) için hazırdır. Bu noktadan sonra sadece bir doğal ürün çıkarma ve arıtma yaprak malzeme, herhangi bir doğal ürün kimyager aşina olan bir iş akışının işlemidir. İlk çıkarma ve sonraki arıtma için birçok farklı yöntem15adlı biri yok. En uygun seçimi yöntemleri ve kullanılan kesin şartlar bahçedeki ilgi yanı sıra beceri ve/veya ekipman kullanılabilirliğini belirli kimyasal özellikleri son derece bağlıdır. Bu protokol için hasat bitki yaprak malzeme körü körüne herhangi bir faiz triterpen ürün için takip edilebilir izole ürün için aşağı akım işlenmesi için bir tam genelleştirilebilir, adım adım yöntemi dahil etmek mümkün değildir, ne de çok olur Bunu yapmak denemek uygun. Ancak, bu iletişim kuralı, bizim laboratuvar ve deneyimlerimize en oksijenli aglycone triterpen ürünler için genelleştirilebilir kanıtladık işleminin, erken aşamaları için bazı yöntemler kullanılan temel iş akışı genel bakış sağlar. Bu iki nispeten nadir teknikleri, yani, basınçlı Solvent Ekstraksiyon (PSE) ve güçlü temel iyon değiştirme reçine kullanarak klorofil kaldırma için uygun hànzú faz yöntemi içerir.

PSE katı matrisleri küçük organik moleküllerin çıkarılması için son derece etkili bir tekniktir. Çekimi (ca. 100-200 bar) basınç altında gerçekleştirilir, kaynama aşan hafifletilmiş sıcaklıklar kullanabilme olmanın en büyük avantajı ayıklama solvent gelin. Bu önemli ölçüde zaman ve solvent ayrıntılı bir emme, basit refluxing veya Soxhlet çekimi16gibi diğer sıcak solvent teknikleri karşılaştırıldığında elde etmek için gerekli miktarı azaltabilir. Ticari tezgah üstü PSE aletleri are elde edilebilir, hangi değiştirilebilir ayıklama hücre ve taşıma, Isıtma ve izleme otomatik çözücü kullanmak. Bu bu teknik son derece elverişli hale getirir. Belki daha az tehlikeli, özellikle sınırlı pratik Kimya deneyime sahip operatörler için de.

Sabunlaşma ham yaprak özler reflü sıvı/sıvı bölümleme tarafından takip altında chlorophylls sonraki arıtma veya analiz önce toplu kaldırılması için ortak bir tekniktir. Ancak, bu kez operasyonel daha büyük ölçeklerde rağbet görebilir. Ayrıca, algılama arabirimi veya ürün kaybı emülsiyonlar oluşumu nedeniyle sorunlu olabilir. Hànzú faz hidroliz gerçekleştirmek için güçlü temel iyon değiştirme reçineler kullanımı uygun bir alternatif hizmet verebilir. Hydrolyzed klorofil pigmentli bölümünü reçine için yapıştırılan kalır ve sadece filtrasyon tarafından kaldırılabilir. Bu iletişim kuralı bir piyasada bulunan temel iyon değiştirme reçine istihdam daha önce raporlanmış analitik prosedür17 partiye hazırlık ölçek uyarlaması kullanır.

Aşağıda bu bitki tabanlı platformu kullanan triterpeneler partiye hazırlık ölçekli üretim için detaylı ve hızlı iletişim kuralı tanımlar. Bu iletişim kuralı onlarca yüzlerce izole triterpen ürün miligram uygulamalar için yapısal bir karakterizasyonu nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi tarafından hazırlamak ve/veya daha fazla fonksiyonel olarak çalışması için düzenli olarak bizim laboratuvar olarak kullanılır deneyleri.

Protocol

Not: Bu protokol sonrası, daha önce kullanılan tüm maddeler için malzeme güvenlik bilgi ile öğrenmeniz ve uygun güvenlik önlemleri alın. Bunlar dahil ancak bunlarla sınırlı değildir: cam vakum altında çalışırken koruyucu gözlük takıyor ve kuru Silis jeli bir duman dolabında taşıma. Bu aynı zamanda yerel mevzuat transgenik malzeme ile çalışma ile ilgili kontrol ve gözlenen, dahil olmak üzere aşağıdaki kapsama yordamlar uygun esastır. 1. A. tumefaciens suşları infiltrasyon için oluşturmak Not: Biz burada uygun A. tumefaciens oluşturmak için gereken adımları için basitleştirilmiş bir açıklama sağlamak için geçici ifade suşları. Daha fazla bilgi aşağıdaki adımlardan Sainsbury vd tarafından açıklanan 8. PCR tarafından yükseltmek veya bölge çevrili 5′ ve 3′ attB diziler kullanmak için bir giriş klonu üretimi için uygun bir siteye özgü rekombinasyon Protokolü18,19klonlama ile ilgi genin kodlama protein sentez. İleri astar kullanın: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTANNNNNNNNNNNNNNNNNN, geriye doğru astar: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTANNNNNNNNNNNNNNNNNN (NNNN… sıra belirli sıra =). (Temsili) PCR koşullar kullanın: reaksiyon karışımı (25 µL, toplam), arabellek (5 x, 5 µL Malzemeler tablobakınız), dNTPs (10 mM, 0.5 µL), ileri astar (10 µM, 1,25 µL), ters astar (10 µM, 1,25 µL), şablon DNA (değişken konsantrasyon, 50-250 ng, 0.5 µL ), DNA polimeraz (2000 U/mL, 0,25 µL, bkz: Malzemeler tablo), nükleaz ücretsiz su (25 µL). Thermocycler aşağıdaki gibi çalıştırın: ilk denatürasyon (98 ° C, 30 s); süreç başlayacak (98 ° C, 30 s; 45 – 72 ° C, 20 s; 72 ° C, 30 s/kb) sona döngüsü; 35 döngüleri; Son uzantısı (72 ° C, 10 dk). Standart bir siteye özgü rekombinasyon Protokolü18,(ticari olarak mevcut olan pDONR207 kullanın) herhangi bir giriş sefaloridin tabanlı vektör kullanarak bir giriş klon üretmek için19 klonlama izleyin.Not: Giriş klon bütünlüğünü sıralama pEAQ -HToluşturmak için kullanmadan önce tarafından onaylanması-DEST1 ifade yapısı. PEAQ -HT-DEST1, Norwich, İngiltere’de John Innes merkezinde Lomonossoff laboratuvarından istek üzerine mevcuttur. PEAQ -HTizole-generated ifade klon DEST1 vektöründen 1.1.3 adım ve mağaza-20 ° C adım 1.3 kullanmadan önce.Not: E. coli suşları klonlama plazmid ayıklamak için tasarlanmış herhangi bir ticari olarak mevcut uygun spin sütunlara göre plazmid arıtma kiti uygundur. Seçilen plazmid arıtma belirli yönergeler kiti ( Tablo malzemelerigörmek) izleyin. Kimyasal olarak yetkili A. tumefaciens dönüşüm için hazır olun. Seçici LB aşılamak (Luria-Bertani Orta: 10 g/L bacto-tryptone, 10 g/M NaCl ve 5 g/L maya ekstresi, agar 10 g/M pH 7,0) A. tumefaciens LBA4404 gliserol hisse senedi kültüründen streaking tarafından agar plaka (50 μg/mL rifampisin, 100 μg/mL streptomisin),. Gecede ayakta kuluçka 28 ° C’de kuluçkaya. 1.2.1. adımdaki A. tumefaciens LBA4404 hücrelerinin bir örnek ile selektif sıvı LB medya (50 μg/mL rifampisin, 100 μg/mL streptomisin) 50 mL aşılamak. Gecede 200 devirde titreyen bir kuluçka 28 ° C’de kuluçkaya. Adım 10 dakika buzda 1.2.2 kültüründen serin ve sonra Santrifüjü 4 ° C ve 5 min (süpernatant silmek) için 4500 x g tarafından A. tumefaciens hücreleri cips. Pelet kimden adım 1.2.3 1 mL buz gibi 20 mM sulu CaCl2 çözüm resuspend ve Santrifüjü adım 1.2.3 (DISCARD süpernatant) arasındaki adımları yineleyin. Kimden adım 1.2.4 1 mL buz gibi 20 mM sulu CaCl2 çözüm ve aliquot elde edilen süspansiyon Pelet 50 µL toplu resuspend. Flash aliquots sıvı N2 ve-80 ° C’de store kullanmak için önceden dondur. Hazırlanmış dönüşümü A. tumefaciens LBA4404 ile izole pEAQ -HT-DEST1 vektör 1.2 adımda oluşturulan. Buz üzerinde 1.2 adımda oluşturulan A. tumefaciens süspansiyon 50 µL çözülme ve izole pEAQ -HT100 \u2012 200 ng ile kuluçkaya-DEST1 vektör, adım 1.1, 0 ° c 5 min için oluşturuldu. Soğuk şok inkübe süspansiyon adım 1.3.1 sıvı N2 30 s, oda sıcaklığına kadar ısıtmak için izin vermek. SOC orta 200 μL ekleyin (SOC: 20 g/L bacto-tryptone, 5 g/L maya ekstresi, 0,58 g/M NaCl, 0,19 g/L KCl, 2.03 g/L MgCl2, 2,46 g/L magnezyum sülfat 7-hidrat, 3,6 g/M glikoz) soğuk şok süspansiyon için 1.3.2 adım ve 28 ° 4 h için kuluçkaya C 200 devirde titreyen bir kuluçka. 1.3.3. adımdaki SOC kültürü ile bir seçici LB agar plaka (50 μg/mL rifampisin, 50 μg/mL sefaloridin, 100 μg/mL streptomisin) aşılamak. İyice yayıldı ve ayakta kuluçka 28 ° C’de 3 gün kuluçkaya. 1.3.4. adımdaki bir koloni ile medyanın seçici LB (50 μg/mL rifampisin, 50 μg/mL sefaloridin, 100 μg/mL streptomisin) 5 mL aşılamak. Gecede 200 devirde titreyen bir kuluçka 28 ° C’de kuluçkaya. Gliserol 200 μL 1 mL sıvı kültürünün 1.3.5 adımından eklemek, iyice karıştırın ve-80 ° C’de depolayınNot: Bu kültür gelecekteki deneyler için uygun antibiyotik (aşağıda açıklanmıştır) LB ağar kaplamalar çizgiler tarafından gündeme. 2. infiltrasyon süspansiyon hazırlamak Seçici LB agar plakalı çizgileri istenen aşılamak A. tumefaciens suşları gliserol gelen stok 1. adımda oluşturulan kültürler. Gecede ayakta kuluçka 28 ° C’de kuluçkaya.Not: THMGR pEAQ -HTiçinde taşıyan bir yük-DEST1 vektör da dahil olabilir. Tek tek seçici LB medya 50 mL her A. tumefaciens soy adım 2.1 yetiştirilen örneği ile aşılamak ve gecede 200 devirde titreyen bir kuluçka 28 ° C’de kuluçkaya. Tek tek adım 2.1.1-1000 mL medyanın seçici LB (rifampisin 50 μg/mL, sefaloridin, 50 μg/mL streptomisin 100 μg/mL) 50 mL kültürler aktarmak ve gecede 200 devirde titreyen bir kuluçka 28 ° C’de kuluçkaya. Tek tek A. tumefaciens 2.1.2 (DISCARD süpernatant) adımda oluşturulan sıvı kültürlerden Santrifüjü tarafından (4000 x g), cips. Tek tek adım 2.1.3 50 mL taze hazırlanmış MMA arabelleği çökeltilerini resuspend (MMA arabellek: 10 mM 2-(N-morpholino)-ethanesulphonic asit, pH 5.6 (KOH), 10 mM MgCl2, 150 mikron 3’5 ‘-dimethoxy-4’-acetophenone) ve içinde oda sıcaklığında kuluçkaya 1 h için karanlık. En az 10 L toplam son birimdeki her zorlanma için 0.2 son OD600 üretmek için her sabah tumefaciens MMA süspansiyon (içinde oluşturulan adım 2.1.4) uygun hacmi birleştirin. Ek MMA arabellek adım 2.1.5 son hacmi 1 L (kullanımda hemen adım 3)’te oluşturulan kombine süspansiyonlar ekleyin.Not: İnfiltrasyon işlemi sırasında sıvı düzeyini korumak için ek bir 2 L infiltrasyon süspansiyon hazırlamak için tavsiye edilir. 1 L 10 x güç MMA arabelleği hazırlayın. 3. gerçekleştirmek vakum infiltrasyon Not: Vakum infiltrasyon cihazları inşaat açıklaması için bkz: Şekil 2 . Kullanmak 5-hafta-yaşlı i. benthamiana bitkiler 9 cm x 9 cm tencere devam etmeden adımlar için. Fidan F1 kompost (Örneğin Levington üzerinden) yılında ekili ve bireysel tencere F2 kompost içeren transfer ediliyor önce 2 hafta boyunca büyüdü. Bitkiler bir sera 16 h günlük, günlük ışık (kullanımı gerektiğinde aydınlatma ek), su ile 25 ° c 100 bitkiler/m2maksimum yoğunluk yetiştirilen. Adım 2 ve 10 x güç MMA arabellek tarafından bir ek 8 L su takip etti infiltrasyonu Bath’a 1 litre oluşturuldu infiltrasyon süspansiyon 1 litre aktarın. Ismarlama tesisi sahibi ayrılabilir wings kaldırmak, 4 bitkiler (5-hafta-yaşlı bitkilerin Yukarıdaki nota bakın) yerleştirin ve kanatları yeniden bağlayın. Sahibi ters çevir ve infiltrasyon süspansiyon yapraklarda daldırın böylece infiltrasyon banyo üzerine yerleştirin.Not: Süspansiyon seviyesi üst yüzeyi bitki sahibinin ulaşır emin olun. Gerekirse ilave infiltrasyon süspansiyon ilavesi ile düzeyini yükseltmek. Batık bitkiler infiltrasyon banyo infiltrasyon odasına aktarmak ve kapıyı kapat. Hava emme valfi yaklaşıyor üzerinde kapalı olun. Vakum Pompası açmak ve infiltrasyon Odası Vakum alımı vana tarafından takip vakum rezervuar için satır içi vanayı aç. Bir kez infiltrasyon odasında basınç tarafından 880 mbar azalttı, vakum alımı kapak ve hava alımı vanayı aç. İnfiltrasyon odası atmosferik basınç için döndü sonra kapıyı aç ve infiltrasyon banyo kaldırın. Bitkiler artık infiltrasyon süspansiyon batık, sonra yavaşça salla aşırı süspansiyon yaprakları infiltrasyon banyo içine çalıştırmak izin sahibi bitki sahibi yükseltmek. Sahibi dik konuma getirin, Sökülebilir kanatları kaldırmak ve bitkiler kaldırmak. Bitkiler için istediğiniz sayıyı sızdığı 3.1.1-3.1.5 tamamlayana dek. Otoklav elden çıkarma önce kullanılan infiltrasyon süspansiyon. Otoklav infiltrasyon banyo yeniden sonraki deneylerde önce. % 70 etanol ile temizleyerek infiltrasyon odası iç sterilize ve hava için yeniden sonraki deneylerde önce kuru bırakın. 4. infiltre bitkiler büyümek Adım 3 100 bitkiler/m2 bir sera içinde maksimum yoğunluk, infiltre bitkilerden düzenleyin. 5 gün için 25 ° C ve 16 h gün ışık (kullanımı gerektiğinde aydınlatma ek) ve su günlük günlük büyümek. 5. hasat infiltre yaprakları Büyüme 5 gün sonra yaprakları hasat. Otoklav atık bitki materyali, tencere ve toprak elden çıkarma önce. 6. hasat yaprakları Kuru Not: Aşağıda açıklanan tam lyophilization yordam kullanılabilir mevcut lyophilization aparatı niteliğine bağlıdır. Hasat yaprakları kadar kuru lyophilize. Hasat yaprakları bir 2 mm kalınlığında Polipropilen torbaya koyun. Hasat yaprakları-80 ° C dondurucu için 30 dk içinde depolayarak dondur. Çantayı PIN kullanarak birçok küçük delikler ile sorgulamaktı. Yer donmuş Torbalı lyophilizer Merkez odasında kalıyor. Tüm şişeyi eki musluklar kapalı ve üzerinde lyophilizer geçiş yapmak olun. Kondansatör en az-50 ° C ulaşır ve en az 0,15 mbar basınç azaltır olun ve gece bırakın. Lyophilizer geçin ve bir şişeye eki dokunun açarak vakum delik. Kurutulmuş yaprakları merkezi odasından kaldırın ve adım 7’ye gidin. 7. basınçlı Solvent Ekstraksiyon Not: Piyasada bulunan bir PSE aracı kullanmaya devam etmeden adımlar bakın (bkz. Tablo malzeme). İşlem hakkında daha ayrıntılı bilgi için üreticinin edebiyat başvurun. Araç 4 çekimi paralel olarak yürütmektedir. Uygun bir yöntem ile bir ders toz haline kurutulmuş yaprakları eziyet (Örneğin, çoğu triterpen bileşikler ilgi için yerli bir mutfak robotu kullanın veya el ile bir çanta içinde yer alan süre yaprakları ezmek).Not: Harç sıvı azot altında bir havaneli ile bileme genellikle gerekli değildir. Yaprak toz Kuvars kum (0.3 \u2012 0.9 mm, hacmen % 20) uygun bir kapta karıştırın; Bu bir uzman davranır ve ayıklama sürecinin etkinliğini artırır. 4 çıkarma hücreleri (120 mL) dolgu için hazırlayın. Bunun için çıkarma hücreleri ters çevir ve metal frit tarafından takip ve fiş holding cam elyaf filtre ekleyin. Dik ayıklama hücrelere konumlandırın ve Kuvars kum 1 cm derin tabakası ekleyin (0.3 \u2012 0.9 mm). Ayıklama hücreleri doldurmak. Ayıklama hücreleri dolgu hattı kadar adım 7.1 generated hazır yaprak tozu ile doldurun. Gerekirse, daha büyük bir miktar her ayıklama hücrede ilavesi kolaylaştırmak için bu işlem sırasında toz hafifçe sıkıştırın. Kuvars kum küçük bir katman ekleyin (0.3 \u2012 0.9 mm) paketlenmiş toz ve INSERT üst selüloz filtre için. PSE enstrüman Paketli ayıklama hücrelere eklediğinizde ve istenen yöntemi. Aşağıdaki ayarları ve malzeme kullanmak; Solvent: % 100 etil asetat; Sıcaklık: 100 ° C, basınç: 130 bar. 3 kür aşağıdaki gibi çalıştırın: 1: 0 dk tutun zaman, dönemi 2 ve 3: 5 dk tutun zaman, 2 dk solvent floş ile sona döngüsü ve 12 dk azot gaz floş.Not: Önce küçük bir ölçekte ayıklama yöntemi en iyi duruma getirmek için tavsiye edilir. Ancak, aşağıdaki yöntemi sık sık en oksitlenmiş triterpen aglycones için yeterlidir. İçki her ayıklama hücreden standart bireysel tahsilat satırları yerine çıkarma hedef olarak atık satır belirterek aynı dış koleksiyonu gemi içinde birleştirilebilir. Kullanılan solvent ekstraksiyon hücreleri ve set sıcaklık ve basınç ambalaj üzerinde bağlıdır unutmayın. Belgili tanımlık yukarıda yöntem genellikle yaklaşık 800 mL ayıklama likör 4 paralel çekimi için oluşturur. Tüm yaprak tozu işlenmiştir 7.2-7.3.3 tamamlayana dek. Kombine ayıklama içki kuruluk, vakum altında döner buharlaşma yoluyla için konsantre. Beklenen çıkış için (yani, koyu yeşil bulamaç) denetleyin.Not: Tam yordam küme bağlı olarak yukarı kullanılabilir rotary evaporatör farklı olabilir. Her zaman döner buharlaşma gerçekleştirirken göz koruma giymek ve cam eşyalar hasar için vakum koşullara tabi önce kontrol edin. Chiller yeniden işleyip kullanı üzerinde açmak ve ısı transferi sıvı az 5 ° c soğutmak izin Su banyosu açın ve sıcaklık 35 ° C’ye ayarlayın Ayıklama içki bir buharlaşma şişesi transfer (şişeye yarısından fazlasını hacmi doldurmayın). İçki batch-wise konsantre (içinde aynı şişeye için) toplam hacim bu aşarsa. Dolgulu buharlaşma şişeye (ortak bir klip ile güvenli) rotary evaporatör, buharı kanalı iliştirin. Şişesi Asansör konumunu ve böylece için alt daldırın açı, ayarlamak, su banyosu buharlaşma şişeye üçüncü bir yaklaşık 45 derecelik açıyla. Ayıklama likör şişesi duvarlarının yukarı yayılmaya başlayan bir hızda dönen balon başlatın. Delik musluk kapalı sağlamak ve (vakum pompası denetleyicisi kullanarak) basıncı azaltmak başlamak kadar ılımlı bir damla kondenser ve alıcı şişeye arasında görülmektedir.Not: Ayıklama içki kaynamaya başlatmak izin vermez. Bu durum ortaya çıkarsa vakum damıtma kontrol altında getirmek için gücünü azaltır. İzlemek ve tüm solvent buharlaşan kadar vakum gücü ve spin hız uygun olarak ayarlayın. 8. temel iyon değiştirme reçine tedavi Chlorophylls kaldırılması için Not: Aşağıdaki adımlarda alıntı miktarları 100 \u2012 150 bitki özgün bir çalışma ölçek varsayıyorum. Adım 8 karboksilik asit grubu veya esterleri gibi temel koşullar altında hidrolize fonksiyonel gruplar içeren ürünler için uygun değildir. Asgari miktar etanol 7 adımda oluşturulan ham özü geçiyoruz. Temel iyon değiştirme reçine boncuk ( Tablo malzemelerigörmek) 50 mL adım 7.1.1 ve sallamak, oda sıcaklığında 30 dakika çıktısını ekleyin.Not: Karıştırma aparatı kullanımı için sallayarak yerine değil. Karıştırarak mıknatıslı veya mekanik yükü reçine boncuk bütünlüğünü tehlikeye sokabilir. Uygun ajitasyon da uygun reaksiyon şişesi rotary Evaporatör üzerinde yavaş dönme atmosferik basınç ayarla veya bağlantısı kesilmiş vakum ile elde edilebilir. Reaksiyon tamamlanması gidene kadar temel iyon değiştirme reçine boncuk her 30 dakikada bir ek 50 mL ekleyin; temel iyon değiştirme reçine boncuk pembe yeşil renkli duruma geçer ve sıvı faz yeşil turuncu veya karanlık bir kahverengi renk ölçeği bağlı olarak değişecektir. Reaksiyon tamamlanması gitti emin değilseniz, 0.5 mL sıvı örnek. Örnek üzerinden atomik dünya’nın küçük sütun filtre ve filtrate rengini gözlemlemek; genellikle 1,5 saat içinde tam bir tepkidir. Reaksiyon karışımı üzerinden atomik dünya’nın kısa sütun filtre. Bu vakum filtrasyon veya basınç uygulamak için el körük kullanarak bir cam flash Kromatografi sütun ile gerçekleştirin. Filtrasyon hızı yavaşlarsa, atomik dünya yastık coşkulu bir çubuk ile üst rahatsız. Filtrate toplamak. Etanol, ardından 1:1 etanol: hekzan ve nihayet hekzan ile toplanan reçineler boncuk durulayın. Atomik dünya sütunun üst kısmında boncuklar resuspend için yeterli bir durulama birimi kullanın. Filtrate adım 8,4 ve adım 8.5 durular birleştirin ve vakum altında döner buharlaşma tarafından kuruluk için konsantre. 9. ilk kaba ayırma Not: Aşağıdaki yöntemi genellikle tipik oksitlenmiş triterpen aglycones için uygundur ve bir otomatik flaş Kromatografi sistemi kullanır. İşlemi hakkında daha fazla bilgi için üreticinin edebiyat bakın. Flash sınıf silika jel üzerine 8. adımda üretilen ham ürün absorbe (gözenek boyutu: 60 Å, parçacık boyutu: 35 \u2012 75 mikron) uygulaması ile Kuru yükleme yöntemi üzerinden bir flash Kromatografi kartuş için. Uygun organik çözücü bir asgari miktar 8 adımda oluşturulan ham ürün geçiyoruz. Tam çözünme sağlamak.Not: Diklorometan metanol birkaç damla ilavesi ile genellikle solvent uygun bir seçimdir. 100 g doldurulmuş flash Kromatografi Kartuş üstündeki sökün ( Tablo malzemelerigörmek) ve kuru yük baş alanı ortaya çıkarmak için Ekle Kaldır. Silika jel kuru yükleme için uygun seviyesini ölçmek için baş alanı kullanın. Silika jel kuru yükleme için ölçülen hacmi ham ürün çözüm için daha sonra vakum altında döner buharlaşma çözücü çıkarın.Not: Bir serbest akışlı toz Silis jeli döndürmelidir. Buharlaşma süreci nazik kazıma sonuna doğru silika jel buharlaşma şişeye tarafındaki ücretsiz gerekebilir. Kartuş içeriği tamamen ve düzgün ıslak olana 100 g flaş Kromatografi kartuş 100 mL/dk ile en az 5 sütun hacimleri % 100 hekzan, ama ideal olarak equilibrate. Hazır kuru yük silika jel dökerek Kuru yük baş alanı dengelenmiş 100 g flaş Kromatografi kartuş 9.1.3. adımda oluşturulan aktarın. Süspansiyon hekzan ve geniş ağızlı bir pipet kalan herhangi bir kuru yük silika jel transferini yardım etmek için kullanılabilir. Islak transfer edilen kuru yük silika jel yatak ile % 100 hekzan hava kuru yük headspace kaldırmak için. Aşağıdaki Kromatografi yöntemi çalıştırmak: Solvent [A]: hekzan, Solvent [B]: etil asetat, akış hızı: 100 mL/dk, degrade: %0 0 [B] üzerinde 3000 mL, koleksiyon [B]: toplamak tüm, kesir boyutu: 250 mL. İnce Tabaka Kromatografi (TLC)8 veya gaz kromatografi-kütle spektrometresi (GC-MS)8ve konsantrasyon kuruluk için kesirler bileşik faiz vakum altında döner buharlaşma yoluyla içeren fraction(s) analiz. Saflık istenen seviyeye ulaşılana kadar aşağı akım iyi arıtma gerçekleştirin.Not: Aşağı akım iyi arıtma tamamen bileşik özeldir ve standart adımları (tartışma bölümüne bakın) sağlamak mümkün değildir.

Representative Results

Tipik izole verimleri enzim/enzim kasanın soruşturma, hedef bahçedeki kimyasal kararlılık ve arıtma süreci zorlu nasıldı altında bağlı. Biz daha önce β-amyrin izole verimi bildirdin 0,12 3.87 mg-gram arasında değişen bizim Kombinatorik biyosentezi deneyler gelen türevleri i. benthamiana yaprak tozu kuru. Bu bileşiklerin yaygın oksidasyon düzeyi arasında değişiyordu ve doğal olmayan enzimler (Şekil 3)8kombinasyonları dahil. Bu iletişim kuralı düzenli olarak bizim laboratuvarda onlarca veya yüzlerce miligram yapısal karakterizasyon için saflaştırılmış ürün üretmek için NMR spektroskopisi ve aşağı akım fonksiyonel deneyleri tarafından kullanılır. Biz de bu platform partiye hazırlık programı triterpen iskele β-amyrin % 98’den büyük bir saflık, 0.8 g üreterek göstermiştir. Bu deney 459 bitkiler kullanılan ve 3.3 mg kuru gram başına izole bir verim temsil eden i. benthamiana yaprak tozu8. Şekil 1: Şematik Özeti. 2,3-oxidosqualene partiye hazırlık ürünler imalatı, yeni yüksek değerli triterpen doğru endojen malzemeleri aktarmak için i. benthamiana varak biyosentetik enzimlerin geçici ifade istismar işlem şematik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 2: Vakum yaklaşıyor İnşaat ve işlem bir) Fabrika sahibi bir kanat müstakil ısmarlama. b) Bespoke tesisi sahibi kanatları bağlı. c) inversiyon ve bitkilerin batma. d) infiltrasyon Bath ekleme. e) infiltrasyon banyoda infiltrasyon odası içinde yer. f) komple vakum yaklaşıyor: (1) vakum pompası (2) bağlantısından vakum pompası vakum rezervuar (3) vakum rezervuar yalıtım Vana vakum rezervuar ve infiltrasyon odası (5) basınç göstergesi (6) hava emme valfi (7) arasında bağlantı (4) İnfiltrasyon odası (8) vakum rezervuar. g) temsilcisi bir bitki yeşil flüoresan protein (GFP) için bir ifade yapısı ile infiltre beş gün sonrası infiltrasyon büyüme sonra bırakır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3: daha önce bu iletişim kuralı8kullanarak β-amyrin türevlerinin partiye hazırlık üretim için temsilcisi sonuçları rapor. Bu tablo tarafından izole verimleri emredilmiştir. Sütunları koşullu olarak göreli değeri renk göstergesi ile biçimlendirilir. Kırmızı Yüksek, yeşil = düşük (yine de ara sarı) =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Yerine aracılığıyla yüksek vakum infiltrasyon rutin olarak bizim laboratuvar olarak çeşitli aşağı akım uygulamaları için ilgi triterpen bileşiklerin partiye hazırlık üretimi için kullanılan için bu iletişim kurallarını sağlar. Burada açıklanan vakum infiltrasyon aparatı kolayca çoğaltılır. Ayrıca vakum baraj gölünün sadece infiltrasyon odası olarak değiştirilmemiş bir vakum fırını repurpose mümkündür ancak gerekli vakum çekmek için gereken süreyi azaltmak için tavsiye edilir. Vakum Pompası uygun bir kondansatör ilavesi ile korumak teorik olarak mantıklı değil, ama bizim laboratuvarda bunun gereksiz olduğunu bulduk.

Yaprakları tamamen infiltrasyon süspansiyon dalmış değil eğer infiltrasyon kapsama güvenilir değil. Bu sorun süspansiyon seviyesi üst yüzeyi bitki sahibinin ulaşır ve bitki sahibi infiltrasyon banyo için sıkı bir seçimdir sağlayarak küçültülür. Şekil 2 ‘ den bitki sahibinin üst yüzeyi içinde yer ne zaman infiltrasyon banyo için gömme olduğunu unutmayın. Bu paneller infiltrasyon banyo üst bağlantı noktasını oluşturan orta kenarları sahibinin tarafından sağlanır. İnfiltrasyon süspansiyon süspansiyon düzeyde tutmak için dönemsel eklemeler gerektirir. Bu en iyi OD600 kademeli azaltma büyük bir batch-wise infiltrasyon boyunca önlemek için aşırı infiltrasyon süspansiyon eklenmesiyle elde edilir. Bu soruşturma quantitively henüz rağmen ancak, bizim ellerimizde ikame su için partiye hazırlık bir ölçekte, göze çarpan etkisi beklenen verimi için görünmüyor. Kaç bitkiler infiltrasyon süspansiyon bir toplu işleminden sızmış hala açık bir soru var. Biz düzenli olarak tek bir toplu iş infiltrasyon süspansiyon, 100 ve 200 bitkilerle arasında sızmak. Buna ek olarak, bazı toprak sızma süspansiyon infiltrasyon işlemi boyunca leach normaldir. Bu infiltrasyon etkinliği üzerinde fark edilebilir bir etkisi için bulunamamıştır.

Hasat sırasında tavsiye (ama kritik değil) sadece sızmış yaprakları toplamaya (biraz yaprak sonrası infiltrasyon büyüdü). Seçici hasat ile Aksi takdirde endojen kirleri göre bileşik faiz oranını artıracak verimsiz doku seyreltme engeller. Bu aşağı akım arıtma kolaylığı nominal bir etkisi vardır ve bu işlemlerin ölçeğini artırır. THMGR habercisi kaynağı artırmak için kullanırken, necrosed bir fenotip sonrası infiltrasyon büyüme döneminde geliştirmek için sık sık görülmektedir. Bu normaldir ve aslında seçici hasat ve aşağı akım kurutma işlemi yardımcı olur. Kurutulmuş yaprak toz genellikle serin, Kuru ve karanlık bir yerde, ama ideal bir desiccator vakum altında kapalı bir kap içinde saklanır. Bu bileşik baktılar istikrar üzerinde bağlıdır. -80 ° C buzlukta saklamak için tercih eğer dikkatli olun. Kurutulmuş sağlamak yapraklar su geçirmez bir kap içinde ve kaldırma depolama, oda sıcaklığında açılış öncesinde ısıtmak için bu kapsayıcıdaki izin. Aksi halde aşağı-stream işleme engelleyen yaprakları, rewetting neden olur.

Bu iletişim kuralı hasat sonrası adımlarda görsel amacıyla sağlanmaktadır ve yardım etmek için pratik Kimya sınırlı olabilir bu araştırmacılar deneyim. Onlar birçok diğer doğal ürün çıkarma/arıtma teknik yedek olabilir. Ayrıntılı olarak giriş, PSE pek çok avantajı vardır, ancak sermaye piyasada bulunan PSE cihazları mal engelleyici olabilir ve gerekli değil. Temel iyon değiştirme reçine tedavi geleneksel sabunlaşma sıvı/sıvı bölümleme tarafından takip değiştirmek için çok uygun bir yöntemdir. Ancak, karboksilik asit grubu veya esterleri gibi temel koşullar altında hidrolize fonksiyonel gruplar içeren ürünler için uygun değildir. Bu ürünler üzerinde temel iyon değiştirme reçine korunabilmesi için beklenir. Ancak, bu bir yakalama için yararlanmak ve yordam (burada belgelenen değil) serbest bırakmak için potansiyel olduğunu. Geleneksel sabunlaşma uygun olacağını nerede temel iyon değiştirme reçine tedavi uygun bir alternatif hizmet vermektedir. Adım 9, açıklanan Kromatografi yöntemi Şekil 3‘ te açıklanan bileşikler için genelleştirilebilir olmak bulunmuştur. Ancak, artan polarite bileşikleri uzun bir % 100 etil asetat elüsyon süre gerektirebilir. Adım 9.2, referansla aşağı akım iyi arıtma tamamen bileşik özeldir ve aynı zamanda ölçekte bağlıdır. En iyi duruma getirilmiş degradelerle daha küçük ölçekli flash Kromatografi tekrarlanan tur bir saflık NMR analizi için uygun ulaşmak için genellikle yeterli. Daha büyük ölçeklerde kristalizasyon kez uygun bir alternatiftir. Zor durumlarda, partiye hazırlık veya yarı partiye hazırlık yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) izole bileşik istenen miktarı bağlı olarak istihdam edilebilir. Aşağı akım arıtma işlemleri için temsilci bileşikleri bir dizi örnekleri8başka bir yerde bulunabilir.

Geçerli protokol, burada anlatılan gibi bizim laboratuarda rutin olarak kullanılan ve yardımcı programı kanıtlamıştır. Ancak, daha fazla en iyi duruma getirme ifade platformu için hala önemli kapsam vardır. Nasıl daha fazla yolu mühendislik araştırmak için bizim laboratuvar çalışmalar sürmektedir ve protein ifade düzeyleri fark kontrolünü toksisite konak hücreleri için arabuluculuk sırasında triterpen üretim daha da artırabilirsiniz. Ayrıca hücre içi taşıma sistemleri20,21manipülasyon ve enzimler artırabilirsiniz yolları farklı hücresel kompartmanlarda22,23, yönünü araştırmak için potansiyel mevcuttur birden çok oksidasyon olayı verimliliği. Anahtar organelleri temel morfolojisi değiştirme için potansiyel yararları da keşfedilmeyi. Örneğin, Arabidopsis thaliana HMGR membran etki alanının overexpression bitkiler24endoplazmik retikulum hipertrofisi ikna etmek için gözlenen; CYP450 etkinliği için önemli bir site. Bu iletişim kuralı ideal miligram triterpen ürünler miktarlarda gram-ölçek için üretimi için uygundur ve bir araştırma ortamda bileşikleri aşağı akım çalışma (Örneğin, sistematik araştırma yapısı-faaliyet için erişmek için istihdam edilecek ilişkiler ve farmakokinetik ve farmakodinamik özellikleri için ön soruşturma kurşun bileşikleri klinik ilgi). Ancak, doğrusal bir platformdur ve güvenilir bir şekilde ölçeklenebilir yeterlidir numarası kullanılan bitkilerin ve agroinfiltration üzerinden geçici ifade pratiklik artırarak ilaç proteinleri için endüstriyel ölçekte gösterilmiştir 14, böylece orada potansiyel yüksek değerli triterpeneler ticari üretimi için genişletilmesi bu platform için. Alternatif olarak, kesinleşmiş arzu multigene biyosentetik yol gidiyorsun, toplu işleme izin sağlam transformants üretim hayal etmek mümkün ve devam eden ‘Transgenik i. benthamiana Tarım’ da suşları ticari değeri farklı bileşikler üreten.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser bir Norwich araştırma Park öğrencilik (JR) tarafından desteklenen, ortak mühendislik ve Fizik Bilimleri Araştırma Konseyi/Biotechnological ve OpenPlant Sentetik Biyoloji Araştırma Merkezi Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi BBSRC tarafından finanse edilen hibe (BB / L014130/1) (M.J.S., A.O.); John Innes merkezi bilgi değişimi ve ticarileştirme vermek (BB/KEC1740/1) (BB); ve BBSRC Enstitüsü Stratejik programı Grant ‘Molekülleri doğadan’ (1/P012523/BB) ve John Innes Vakfı (Ao). George pEAQ vektörler sağlamak için Lomonossoff ve Andrew Davis Fotoğrafçılık için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

GC-MS instrument any n/a
Thermocycler suitable for performing PCR reactions any n/a
Gel electrophoresis apparatus any n/a
Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) any n/a
Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L) any n/a
Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/> 15000 rpm) any n/a
Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/> 4000 rpm) any n/a
Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/> 4000 rpm) any n/a
Standing incubator any n/a
Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L) any n/a
Centrifuge bottles (1 L) any n/a
Vacuum infiltration apparatus bespoke n/a
9 x 9 cm plant pots any n/a
Freeze drying apparatus (=/> 8 litre condenser capacity) any n/a
Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument) Buchi SpeedExtractor E-914
Rotary evaporator apparatus any n/a
Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L) any n/a
Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L) any n/a
Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L) any n/a
Spatulas (assorted sizes) any n/a
Analytical balance (5 figures) any n/a
Balance (2 figures) any n/a
Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L) any n/a
A -80 freezer any n/a
Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument Biotage ISO-1EW
Safety glasses any n/a
Lab coat any n/a
Autoclave any n/a
Consumables
Micropipette tips (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) any n/a
Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL) any n/a
Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL) any n/a
Disposable Transfer pipettes (size 2 mL) any n/a
Petri dishes (Size: 100 mL) any n/a
Biotage® SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges Biotage FSK0-1107-0100
HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps any n/a
Disposable purple nitrile gloves any n/a
Top filter for E-914, cellulose Buchi 51249
Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber Buchi 11055932
Reagents
Quartz sand, 0.3 – 0.9 mm Buchi 37689
Celite 545 (diatomaceous earth) Simga-Alrich 22140-1KG-F
Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm) Merck 1.09385.5000
2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid Melford B2002
MgCl2 Simga-Alrich 208337-100G
KOH Simga-Alrich 60377-1KG
3’5’-dimethoxy-4’-acetophenone (acetosyringone) Simga-Alrich D134406-1G
Rifampicin Alfa Aesar J60836
Kanamycin sulfate Gibco 11815-032
Streptomycin Simga-Alrich S6501-100G
Gentamycin MP biomedicals 190057
Agarose LE gel Melford MB1203
LB broth Millar Simga-Alrich L3522-250G
Agar Simga-Alrich A5306-250G
NaCl Simga-Alrich S5886-500G
KCl Simga-Alrich P9541-500G
MgSO4.7H2O Sigma-Alrich M2773-500G
Glucose Sigma-Alrich G7021-100G
Ambersep® 900 hydroxide (basic ion exchange resin) Sigma-Alrich 06476-1KG
Hexane Fisher H/0406/PB17
Ethyl acetate Fisher E/0900/PB17
Dichloromethane Fisher D/1852/PB17
Methanol Fisher M/4056/PB17
Ethidium bromide Sigma-Alrich E7637-1G
Ethanol VWR 20821-330
Milli-Q water any n/a
Levington F1 Compost any n/a
Levington F2 Compost any n/a
QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit). Qiagen 27104
NEB 5-alpha Competent E. coli Supplier New England Biolabs Ltd C2987I
pEAQ-HT-DEST1 vector Lomonossoff laboratory John Innes Center n/a
pDONR207 Thermo-Fisher pDONR207
A. tumefaciens LBA4404 Thermo-Fisher 18313015
GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) Thermo-Fisher 11791020
GATEWAY BP CLONASE ™ II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) Thermo-Fisher 11789020
GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX Promega UK Ltd M7822
PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE New England Biolabs Ltd M0530S
dNTP SET 100mm Thermo-Fisher 10297018
RNEASY PLANT MINI KIT Qiagen Ltd 74904
RQ1 RNASE-FREE DNASE Promega UK Ltd M6101
Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System Fisher 10308632
Trytone Sigma-Alrich T7293-250G
Nicotiana benthamiana seeds any reputable supplier n/a
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thimmappa, R., et al. Triterpene biosynthesis in plants. Annual Review of Plant Biology. 65, 225-257 (2014).
  2. Seki, H., Tamura, K., Muranaka, T. P450s and UGTs: Key players in the structural diversity of triterpenoid saponins. Plant Cell Physiology. 56 (8), 1463-1471 (2015).
  3. Roy, A., Saraf, S. Limonoids: overview of significant bioactive triterpenes distributed in plants kingdom. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 29 (2), 191-201 (2006).
  4. Kamble, S. M., Goyal, S. N., Patil, C. R. Multifunctional pentacyclic triterpenoids as adjuvants in cancer chemotherapy: a review. RSC Advances. 4 (63), 33370-33382 (2014).
  5. Liby, K. T., Sporn, M. B. Synthetic oleanane triterpenoids: multifunctional drugs with a broad range of applications for prevention and treatment of chronic disease. Pharmacological Reviews. 64 (4), 972-1003 (2012).
  6. Yadav, V. R., et al. Targeting inflammatory pathways by triterpenoids for prevention and treatment of cancer. Toxins. 2 (10), 2428-2466 (2010).
  7. Christensen, L. P. Ginsenosides chemistry, biosynthesis, analysis, and potential health effects. Advances in Food and Nutrition Research. 55, 1-99 (2009).
  8. Reed, J., et al. A translational synthetic biology platform for rapid access to gram-scale quantities of novel drug-like molecules. Metabolic Engineering. 42, 185-193 (2017).
  9. Andersen-Ranberg, J., et al. Expanding the landscape of diterpene structural diversity through stereochemically controlled combinatorial biosynthesis. Angewandte Chemie International Edition. 55 (6), 2142-2146 (2016).
  10. Peyret, H., Lomonossoff, G. P. The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants. Plant Molecular Biology. 83, 51-58 (2013).
  11. Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).
  12. Sainsbury, F., Lomonossoff, G. P. Extremely high-level and rapid transient protein production in plants without the use of viral replication. Plant Physiology. 148 (3), 1212-1218 (2008).
  13. Voinnet, O., et al. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. The Plant Journal. 33 (5), 949-956 (2003).
  14. Holtz, B. R., et al. Commercial-scale biotherapeutics manufacturing facility for plant-made pharmaceuticals. Plant Biotechnology Journal. 13 (8), 1180-1190 (2015).
  15. Bucar, F., Wubea, A., Schmidb, M. Natural product isolation – how to get from biological material to pure compounds. Natural Product Reports. 30, 525-545 (2003).
  16. Kaufmann, B., Christen, P. Recent extraction techniques for natural products: microwave-assisted extraction and pressurised solvent extraction. Phytochemical Analysis. 13 (2), 105-113 (2002).
  17. Larsen, E., Christensen, L. P. Simple saponification method for the quantitative determination of carotenoids in green vegetables. Journal of Archaeological and Food Chemistry. 53 (17), 6598-6602 (2005).
  18. Sainsbury, F., et al. Using a virus-derived system to manipulate plant natural product biosynthetic pathways. Methods Enzymology. , 185-202 (2012).
  19. Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA Cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research. 10, 1788-1795 (2000).
  20. Ting, H., et al. SNARE-RNAi results in higher terpene emission from ectopically expressed caryophyllene synthase in Nicotiana benthamiana. Molecular Plant. 8, 454-466 (2015).
  21. Wang, B., et al. Transient production of artemisininin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua. Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).
  22. Nielsen, A. Z., et al. Redirecting photosynthetic reducing power toward bioactive natural product synthesis. ACS Synthetic Biology. 2, 308-315 (2013).
  23. Dong, L., et al. Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments. New Phytologist. 209, 679-690 (2016).
  24. Ferrero, S., et al. Proliferation and morphogenesis of the endoplasmic reticulum driven by the membrane domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A reductase in plant cells. Plant Physiology. 168, 899-914 (2015).

Tags

Transient ExpressionNicotiana BenthamianaTriterpene ProductionPreparative ScaleAgrobacterium TumefaciensCo-infiltrationVacuum InfiltrationMMA BufferOD 600Preparative-scale AccessStructural CharacterizationMedicinally Relevant Biological ActivitySelective LB AgarSelective LB MediaCentrifugationResuspensionInfiltration Suspension

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Stephenson, M. J., Reed, J., Brouwer, B., Osbourn, A. Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale. J. Vis. Exp. (138), e58169, doi:10.3791/58169 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image