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Biochemistry

Espressione transiente in Nicotiana Benthamiana lascia per produzione del Triterpene su scala preparativa

Published: August 16, 2018
doi:
10.3791/58169
, , ,
1John Innes Centre

Summary

L’espressione eterologa transitoria degli enzimi biosintetici in foglie di Nicotiana benthamiana può deviare endogene forniture di 2,3-oxidosqualene verso la produzione di nuovi prodotti ad alto valore triterpenici. Qui è descritto un protocollo dettagliato per produzione preparativo-scala rapidamente (5 giorni) di triterpeni e analoghi utilizzando questa potente piattaforma di origine vegetale.

Abstract

I triterpeni sono uno dei più grandi e la maggior parte delle famiglie strutturalmente diversificata di prodotti naturali vegetali. Molti derivati triterpenici hanno dimostrati di possedere attività biologica in medicina pertinenti. Tuttavia, finora questo potenziale non è tradotto in una pletora di farmaci derivati triterpenici nella clinica. Questo è probabilmente (almeno parzialmente) una conseguenza dell’accesso sintetico pratica limitata a questa classe di composti, un problema che può soffocare l’esplorazione delle relazioni struttura-attività e lo sviluppo di condurre i candidati da tradizionali medicinali flussi di lavoro di chimica. Nonostante la loro diversità immensa, triterpeni sono tutti derivati da un singolo precursore lineare, 2,3-oxidosqualene. L’espressione eterologa transitoria degli enzimi biosintetici in N. benthamiana può deviare endogene forniture di 2,3-oxidosqualene verso la produzione di nuovi prodotti di alto valore triterpene che non sono prodotte naturalmente da questo host. Agro-infiltrazione è uno strumento semplice ed efficace espressione transiente in N. benthamiana. Il processo prevede l’infiltrazione delle foglie delle piante con una sospensione di Agrobacterium tumefaciens che trasportano il construct(s) di espressione di interesse. Co-infiltrazione di un ulteriore a. tumefaciens ceppo che trasportano un costrutto di espressione codifica un enzima che aumenta il rifornimento di precursore significativamente aumenta produce. Dopo un periodo di cinque giorni, il materiale infiltrato foglia possa essere raccolti ed elaborato per estrarre e isolare i prodotti triterpene risultante. Si tratta di un processo che è scalabile in modo lineare e affidabile, semplicemente aumentando il numero delle piante utilizzate nell’esperimento. Qui è descritto un protocollo per produzione rapida di preparativo-scala di triterpeni che utilizzano questa piattaforma vegetale. Il protocollo utilizza un apparato di infiltrazione vuoto facilmente replicabili, che permette l’infiltrazione simultanea di fino a quattro impianti, consentendo l’infiltrazione batch-wise di centinaia di piante in un breve periodo di tempo.

Introduction

I triterpeni sono uno dei più grandi e la maggior parte delle famiglie strutturalmente diversificata di prodotti naturali vegetali. Nonostante la loro diversità immensa, tutti i prodotti naturali del triterpene sono creduti per essere derivato dalla stessa lineare precursore 2,3-oxidosqualene, un prodotto della via del mevalonate nelle piante. Ciclizzazione di 2,3-oxidosqualene è avviato e controllato da una famiglia di enzimi chiamati oxidosqualene ciclasi (OSSC). Questo passaggio di ciclizzazione rappresenta il primo livello di diversificazione, con centinaia di diversi triterpene impalcature che sono segnalate da natura1. Queste impalcature sono ulteriormente diversificate di sartoria enzimi tra cui, ma non limitato a, citocromo p450s (CYP450s)1,2. Tali vie biosintetiche possono portare a immensa complessità, a volte con conseguente prodotti finali che sono a malapena riconoscibili dal triterpene del padre. Ad esempio, la complessa struttura del potente insetticida e antifeedant Limonoide azadiractina è creduta per derivare da un triterpene tetraciclico del tirucallane tipo3.

Molti prodotti naturali derivati triterpenici, anche quelli con impalcature padre relativamente invariato, hanno dimostrati di possedere attività biologica in medicina pertinenti4,5,6,7. Tuttavia, finora questo potenziale non è tradotto in una pletora di farmaci derivati triterpenici nella clinica. Questo è probabilmente (almeno parzialmente) una conseguenza dell’accesso sintetico pratica limitata a questa classe di composti, un problema che può soffocare l’esplorazione delle relazioni struttura-attività e lo sviluppo di condurre i candidati da tradizionali medicinali flussi di lavoro di chimica.

L’espressione transitoria degli enzimi biosintetici del triterpene da altre specie di piante a foglie N. benthamiana può deviare endogene forniture di 2,3-oxidosqualene verso la produzione di nuovi prodotti ad alto valore triterpenici (Figura 1). Questo processo può essere utilizzato per caratterizzare funzionalmente enzimi candidato e ricostruire le vie biosintetiche dei metaboliti importanti naturale. Ugualmente, può anche essere sfruttato negli approcci combinatoriali biosintetici di produrre prodotti di romanzo del triterpene, una strategia che può provocare nelle librerie di analoghi strutturalmente correlate, consentendo l’esplorazione sistematica delle relazioni struttura-attività 8,9i composti di piombo biologicamente attivo.

Agroinfiltrazione è uno strumento semplice ed efficace espressione transiente in N. benthamiana foglie. Il processo prevede l’infiltrazione di foglie con una sospensione di a. tumefaciens che trasportano il construct(s) di espressione binaria di interesse. Questo risultato è ottenuto tramite l’applicazione di pressione che costringe il liquido attraverso gli stomi, spostando l’aria nello spazio intercellulare e la sua sostituzione con la sospensione di a. tumefaciens . I batteri trasferire i rispettivi T-DNA all’interno delle cellule della pianta, con conseguente espressione della proteina localizzata e transitori in tessuto fogliare infiltrate.

Mentre qualsiasi vettore binario adatto per generazione di piante transgeniche possono essere impiegate per l’espressione transitoria, utilizziamo la Cowpea Mosaic Virus CPMV-derivato Hypertranslational (HT) proteina espressione sistema10, 11. in questo sistema il gene di interesse è fiancheggiato da regioni non tradotte (UTR) da CPMV RNA-2. 5′ UTR contiene modifiche risultanti a livelli molto elevati di traduzione della proteina con nessun affidamento sulla replicazione virale12. Questa tecnica è stata sviluppata in serie di vettore binario di facile e rapido (pEAQ) che comprende la clonazione protocollo compatibile con costrutti (pEAQ –HT– DEST)10,11site-specific di ricombinazione. La maggior parte pEAQ vettori contengono anche un pomodoro bushy stunt virus-derivato P19 silenziamento suppressor gene13 all’interno della parte di T-DNA della cassetta di espressione, che aggira la necessità di coinfiltrate un ceppo P19-trasportare separato e offre molto espressione di proteine ad alto livello nell’ospite pianta cella10,11.

Uso di N. benthamiana come un host di espressione ha particolari vantaggi quando si lavora con vie biosintetiche pianta. L’architettura cellulare supporta intrinsecamente appropriato mRNA e proteina elaborazione e compartimentalizzazione corretta, oltre a possedere le necessari co-enzimi, riduttasi (per CYP450s) e precursori metabolici. Fonte di carbonio è la fotosintesi; così, piante possono essere coltivate semplicemente in compost di qualità buona, che richiedono solo acqua, CO2 (dall’aria) e luce del sole come input. La piattaforma è anche estremamente conveniente per la co-espressione di diverse combinazioni di proteine, come questo può essere raggiunto facilely per co-infiltrazione di diversi ceppi di a. tumefaciens, negando la necessità di costruire grandi espressione multigenica cassette. Inoltre, il processo può essere linearmente e affidabile scalato semplicemente aumentando il numero delle piante utilizzate nell’esperimento.

Lavoro precedente nel nostro laboratorio ha dimostrato l’utilità di questa piattaforma per esperimenti su scala preparativa. Questo incluso la preparazione di triterpeni romanzo per uso in saggi di bioattività e scala fino a raggiungere la quantità di grammi di prodotto isolato. Inoltre, può essere aumentato accumulo di prodotti eterogenei triterpene molteplice di co-espressione di una forma N-terminal-troncato, feedback-insensibile di 3-idrossi, 3-methyglutary-coenzima A reduttasi (tHMGR), una limitazione della velocità a Monte enzima in mevalonate pathway8.

Chiave per tali esperimenti preparativo-scala è la capacità di up-scala convenientemente il processo di infiltrazione. In un tipico esperimento, decine o centinaia di piante possono essere necessaria per raggiungere la quantità di destinazione del prodotto isolato. Le singole foglie di infiltrazione a mano (usando una siringa inutile) è funzionalmente esigente e spesso costi proibitivi che richiede tempo, rendendo questo metodo poco pratico per scale-up routine. Infiltrazione vuoto offre vantaggi rispetto l’infiltrazione di mano, poiché non è dipenda dal livello di abilità dell’operatore e consente l’infiltrazione di una maggiore area della superficie fogliare. Questa procedura è usata commercialmente per la produzione su larga scala di proteine farmaceutici14. Questo protocollo utilizza un apparato di infiltrazione vuoto facilmente replicabili, che può essere costruito da parti commercialmente disponibili. Questo consente l’infiltrazione simultanea di fino a 4 piante, offrendo l’infiltrazione batch-wise rapido e pratico di centinaia di piante in un breve periodo di tempo (Figura 2a -2b). L’apparato di infiltrazione vuoto è costituito da un forno sotto vuoto che forma la camera di infiltrazione (Figura 2f). Il forno è collegato ad una pompa tramite un serbatoio a vuoto. Questo riduce notevolmente il tempo necessario per ottenere il vuoto desiderato nella camera di infiltrazione. Le piante sono fissate in un supporto su misura e invertite in un bagno di 10 L d’acqua in acciaio inox riempito con sospensione a. tumefaciens (Figura 2a -2C). Completa immersione delle parti aeree delle piante è importante per l’infiltrazione efficace. Bagno d’acqua viene poi collocato all’interno della camera di infiltrazione (figura 2d -2e) e il vuoto applicato per disegnare l’aria fuori gli spazi interstiziali di foglia. Una volta che la pressione è stata ridotta da 880 mbar (un processo che dura circa 1 min) la camera di infiltrazione è portata rapidamente indietro a pressione atmosferica oltre 20-30 s aprendo la valvola di aspirazione del forno, dopo di che l’infiltrazione è completa.

Cinque giorni dopo l’infiltrazione di materiale vegetale è pronto per la raccolta e la successiva estrazione e l’isolamento del prodotto desiderato. Da questo punto il processo è semplicemente uno dei prodotto naturale estrazione e purificazione da materiale del foglio, un flusso di lavoro che è familiare a qualsiasi chimico prodotto naturale. Molti metodi diversi per l’iniziale estrazione e purificazione successiva esistono15. La scelta più appropriata di metodi e le condizioni esatte utilizzate dipende fortemente le particolari proprietà chimiche del composto di interesse, oltre alla disponibilità di competenze e/o attrezzature. Non è possibile includere in questo protocollo un metodo completamente generalizzabile, passo-passo per l’elaborazione a valle del materiale raccolto pianta foglia isolato prodotto che potrebbe essere seguito ciecamente per qualsiasi prodotto del triterpene di interesse, né sarebbe appropriato per tentare di farlo. Tuttavia, questo protocollo fornirà una panoramica del flusso di lavoro base utilizzato nel nostro laboratorio e alcuni metodi per le fasi iniziali del processo, che nella nostra esperienza si sono rivelati generalizzabile per prodotti di triterpene aglicone più ossigenati. Questo include due tecniche relativamente rari, vale a dire, estrazione pressurizzata di solvente (PSE) e un metodo conveniente fase eterogenea per la rimozione di clorofilla utilizzando una resina a scambio ionico fortemente basico.

PSE è una tecnica altamente efficiente per l’estrazione di piccole molecole organiche da matrici solide. Le estrazioni vengono eseguite sotto pressione (ca. 100-200 bar), scegliere il vantaggio principale è la possibilità di utilizzare alleviò le temperature che superano il punto di ebollizione del solvente di estrazione. Questo può ridurre significativamente il tempo e la quantità di solvente necessario per ottenere un’estrazione esaustiva, rispetto ad altre tecniche di solvente caldi come semplice riflusso o Soxhlet estrazioni16. Strumenti commerciali di PSE banco sono disponibili, che utilizzano cellule di estrazione intercambiabili e solvente automatizzati movimentazione, riscaldamento e monitoraggio. Questo rende questa tecnica estremamente conveniente. È anche probabilmente meno pericoloso, in particolare per gli operatori con esperienza di chimica pratica limitata.

Saponificazione di estratti grezzi foglia sotto riflusso seguita da liquido/liquido partizionamento è una tecnica comune per la rimozione di massa delle clorofille prima purificazione successiva o analisi. Tuttavia, questo può spesso essere operativamente esigenti su scala più ampia. Inoltre, la rilevazione dell’interfaccia, o della perdita del prodotto dovuta alla formazione di emulsioni può essere problematico. L’uso di resine scambiatrici di ioni fortemente basico per eseguire idrolisi in fase eterogenea può servire come una comoda alternativa. La parte pigmentata della clorofilla idrolizzata rimane aderita alla resina e può essere semplicemente rimossi per filtrazione. Questo protocollo utilizza un adattamento di scala preparativa di un procedimento analitico precedentemente segnalati17 che si avvale di una resina a scambio ionico base disponibili in commercio.

Qui di seguito descriviamo un protocollo dettagliato e rapido per la produzione su scala preparativa di triterpeni che utilizzano questa piattaforma vegetale. Questo protocollo viene utilizzato ordinariamente nel nostro laboratorio per preparare decine o centinaia di milligrammi del triterpene isolato prodotto per applicazioni tale caratterizzazione strutturale mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR), e/o ulteriore studio in funzionale saggi.

Protocol

Nota: Prima di seguire questo protocollo, acquisire familiarità con i dati di materiale di sicurezza per tutte le sostanze utilizzate e prendere opportune misure di sicurezza. Questi includono ma non sono limitati a: indossare occhiali di sicurezza quando si lavora con il vetro sotto vuoto e asciutto gel di silice in una cappa di movimentazione. È anche essenziale che locale in materia di utilizzo di materiale transgenico è controllato e osservato, tra cui segue procedure di contenimento del caso. 1. generare ceppi di a. tumefaciens per infiltrazione Nota: Qui forniamo una descrizione semplificata dei passaggi necessari per generare adatto a. tumefaciens ceppi per espressione transitoria. Ulteriori dettagli su questi passaggi sono descritti da Sainsbury et al. 8. Amplificare mediante PCR o sintetizzare la proteina codificante del gene di interesse fiancheggiato da sequenze di attB 5′ e 3′ adatte per la generazione di un clone di voce per l’uso con una ricombinazione site-specific clonazione protocollo18,19. Utilizzare il primer Forward: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTANNNNNNNNNNNNNNNNNN, Reverse primer: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTANNNNNNNNNNNNNNNNNN (NNNN… = sequenza specifica sequenza). Utilizzare (rappresentante) condizioni di PCR: reazione miscela (25 µ l, totale), di tampone (5x, 5 µ l, Vedi Tabella materiali), dNTP (10 mM, 0,5 µ l), Forward primer (10 µM, 1.25 µ l), Reverse primer (10 µM, 1.25 µ l), modello DNA (concentrazione variabile, 50 – 250 ng, 0,5 µ l ), DNA polimerasi (2000 U/mL, 0,25 µ l, Vedi Tabella materiali), acqua priva di nucleasi (a 25 µ l). Eseguire il termociclatore come segue: denaturazione iniziale (98 ° C, 30 s); avvio ciclo (98 ° C, 30 s; 45 – 72 ° C, 20 s; 72 ° C, s/30kb) fine ciclo; 35 cicli; estensione finale (72 ° C, 10 min). Seguire una ricombinazione di site-specific standard clonazione protocollo18,19 per generare un clone di voce utilizzando qualsiasi vettore di ingresso non basati su kanamicina (usiamo pDONR207 che è disponibile in commercio).Nota: L’integrità del clone voce dovrebbe essere confermata dall’ordinamento, prima di utilizzare per generare il pEAQ -HT-DEST1 costrutto di espressione. PEAQ -HT-DEST1 è disponibile su richiesta presso il laboratorio di Lomonossoff presso il John Innes Centre a Norwich, UK. Isolare il pEAQ -HT-DEST1 vettore dal clone espressione generato nel passaggio 1.1.3 e conservare a-20 ° C prima dell’uso nel passaggio 1.3.Nota: Qualsiasi kit di purificazione del plasmide basata su colonne commercialmente disponibile spin conveniente progettato per l’estrazione di plasmidi da clonazione ceppi di e. coli è adatto. Seguire le istruzioni specifiche della purificazione del plasmide selezionate kit (Vedi Tabella materiali). Preparare chimicamente competenti a. tumefaciens per trasformazione. Inoculare un selettivo LB (Luria-Bertani medio: bacto-tryptone di 10 g/L, 10 g/L NaCl e 5 g/L estratto di lievito, agar 10 g/L pH 7.0) piastra di agar (50 μg/mL rifampicina, streptomicina 100 μg/mL), da striature a. tumefaciens LBA4404 da una cultura di stock di glicerolo. Incubare per una notte a 28 ° C in un incubatore in piedi. Inoculare 50ml di terreni selettivi LB liquido (50 μg/mL rifampicina, 100 μg/mL streptomicina) con un campione di cellule di a. tumefaciens LBA4404 dal punto 1.2.1. Incubare per una notte a 28 ° C in un incubatore d’agitazione a 200 giri/min. Raffreddare la cultura dal punto 1.2.2 in ghiaccio per 10 min e poi agglomerare le cellule di a. tumefaciens mediante centrifugazione a 4 ° C e 4500 x g per 5 min (scartare il surnatante). Risospendere il pellet dal punto 1.2.3 in 1 mL di soluzione acquosa al2 CaCl ghiacciata 20mm e ripetere il passo di centrifugazione dal punto 1.2.3 (scartare il surnatante). Risospendere il pellet da punto 1.2.4 in 1 mL di soluzione di 20mm ghiacciata acquosa CaCl2 e aliquota la sospensione risultante in a lotti di 50 µ l. Flash congelare le aliquote in liquido N2 e conservare a-80 ° C prima dell’uso. Trasformare il preparato a. tumefaciens LBA4404 con l’isolato pEAQ -HT-DEST1 vettoriale generato nel passaggio 1.2. 50 µ l di sospensione di a. tumefaciens generato nel passaggio 1.2 sul ghiaccio di scongelare e incubare con 100 \u2012 200 ng di isolato pEAQ -HT-DEST1 vettoriale, generato nel passaggio 1.1, a 0 ° C per 5 min. Freddo di scossa della sospensione incubata dal punto 1.3.1 in liquido N2 per 30 s, quindi consentire a temperatura ambiente. Aggiungere 200 μL di mezzo SOC (SOC: bacto-tryptone di 20 g/L, Estratto di lievito 5 g/L, 0,58 g/L NaCl, KCl 0,19 g/L, 2,03 g/L di MgCl2, 7-idrato del solfato di magnesio di 2,46 g/L, glucosio 3,6 g/L) per la sospensione freddo scioccata dal passaggio di 1.3.2 e incubare per 4 ore a 28 ° C in un incubatore d’agitazione a 200 giri/min. Inoculare una piastra di agar selettiva LB (50 μg/mL rifampicina, kanamicina di 50 μg/mL, 100 μg/mL streptomicina) con la cultura SOC dal punto 1.3.3. Sparso accuratamente e incubare per 3 giorni a 28 ° C in un incubatore in piedi. Inoculare 5 mL di LB terreni selettivi (50 μg/mL rifampicina, kanamicina di 50 μg/mL, 100 μg/mL streptomicina) con una singola Colonia dal punto 1.3.4. Incubare per una notte a 28 ° C in un incubatore d’agitazione a 200 giri/min. Aggiungere 200 μL di glicerolo a 1 mL di coltura liquida dal punto 1.3.5, mescolare accuratamente e conservare a-80 ° C.Nota: Questa cultura può essere rianimata per futuri esperimenti da striature sulle piastre di agar LB con gli antibiotici adatti (descritti sotto). 2. preparare la sospensione di infiltrazione Inoculare una piastra di agar selettiva LB con striature del desiderato a. tumefaciens ceppi dal glicerolo stock culture generate nel passaggio 1. Incubare per una notte a 28 ° C in un incubatore in piedi.Nota: Un ceppo che trasportano tHMGR all’interno di un pEAQ -HT-DEST1 vettore può anche essere incluso. Individualmente inoculare in 50 mL di terreni selettivi LB con un campione di ogni ceppo di a. tumefaciens coltivato nel passaggio 2.1 e incubare per una notte a 28 ° C in un incubatore d’agitazione a 200 giri/min. Individualmente le culture di 50ml di trasferimento dal punto 2.1.1 a 1000 mL di LB terreni selettivi (rifampicina 50 μg/mL, kanamicina, 50 μg/mL streptomicina 100 μg/mL) e incubare per una notte a 28 ° C in un incubatore d’agitazione a 200 giri/min. Singolarmente a pellet a. tumefaciens mediante centrifugazione (4000 x g), dalle colture del liquide generate nel passaggio 2.1.2 (scartare il surnatante). Individualmente risospendere il pellet da punto 2.1.3 in 50 mL di buffer di MMA preparata al momento (MMA Buffer: 10 mM 2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acido, pH 5,6 (KOH), 10mm MgCl2, 150 μM 3’5 ‘-dimethoxy-4’-acetofenone) e incubare a temperatura ambiente in al buio per 1 h. Combinare il volume appropriato di ogni sospensione di a. tumefaciens MMA (generato nel passaggio 2.1.4) per produrre un finale OD600 di almeno 0,2 per ogni sforzo in un volume finale totale 10 L. Aggiungere ulteriori MMA tampone per le sospensioni combinate generate nel passaggio 2.1.5 ad un volume finale di 1 L (uso immediatamente nel passaggio 3).Nota: Si consiglia di preparare un ulteriore 2 L di sospensione di infiltrazione per mantenere il livello del liquido durante il processo di infiltrazione. Preparare 1 L di tampone di 10 x forza MMA. 3. eseguire l’infiltrazione sotto vuoto Nota: Per una descrizione della costruzione di apparecchi di infiltrazione vuoto, vedere Figura 2 . Utilizzare 5-settimana-vecchio N. benthamiana piante in vaso 9 x 9 cm per le fasi del procedimento. Semenzali dovrebbero essere seminati in F1 composta (ad es. da Levington) e cresciuti per 2 settimane prima di essere trasferito a singoli vasi contenenti F2 compost. Piante devono essere coltivate in una serra a 25 ° C, con 16 h al giorno di luce acqua (uso supplementare di illuminazione quando richiesto), ogni giorno, densità massima di 100 piante/m2. Trasferire il 1 L di sospensione di infiltrazione generato nel passaggio 2 e 1 L di 10X tampone di MMA di forza per il bagno di infiltrazione, seguito da un ulteriore 8 L di acqua. Rimuovere le ali staccabili del titolare impianto su misura, inserire 4 piante (piante week-old 5 vedono nota precedente) e ricollegare le ali. Il titolare e posizionarlo sopra il bagno di infiltrazione in modo da immergere le foglie nella sospensione di infiltrazione.Nota: Garantire che il livello di sospensione raggiunge la superficie superiore del titolare all’impianto. Aumentare il livello con l’aggiunta della sospensione di infiltrazione supplementare se necessario. Trasferimento del bagno di infiltrazione con piante sommerse alla camera di infiltrazione e chiudere la porta. Assicurati che la valvola di aspirazione aria è chiusa sull’infiltrator. Accendere la pompa del vuoto e aprire la valvola in linea per il serbatoio vuoto seguita da valvola di aspirazione del vuoto sulla camera di infiltrazione. Una volta che la pressione nella camera di infiltrazione è ridotto da 880 mbar, chiudere la valvola di aspirazione del vuoto e aprire la valvola di aspirazione aria. Una volta che la camera di infiltrazione ha restituito alla pressione atmosferica, aprire la porta e rimuovere la vasca di infiltrazione. Sollevare il titolare pianta finché le piante non sono sommerse la sospensione di infiltrazione, poi agitare delicatamente il titolare per consentire la sospensione in eccesso eseguire fuori dai fogli nuovamente dentro la vasca di infiltrazione. Restituire il titolare in posizione verticale, rimuovere le ali staccabili e rimuovere le piante. Ripetere i passaggi 3.1.1 a 3.1.5 il numero desiderato di piante si è infiltrato. Sterilizzare in autoclave la sospensione di infiltrazione usato prima dello smaltimento. Autoclave l’infiltrazione del bagno prima del riutilizzo in esperimenti successivi. Sterilizzare l’interno della camera di infiltrazione di pulizia con etanolo al 70% e lasciare all’aria secca prima del riutilizzo in esperimenti successivi. 4. far crescere le piante infiltrate Organizzare le piante infiltrate dal passaggio 3 ad una densità massima di 100 piante/m2 in una serra. Crescere per 5 giorni a 25 ° C e 16 h al giorno di luce (uso supplementare di illuminazione quando richiesto) e acqua ogni giorno. 5. raccogliere le foglie infiltrate Dopo 5 giorni di crescita, raccogliere le foglie. Il materiale in autoclave dei rifiuti vegetali, pentole e terreno prima dello smaltimento. 6. asciugare le foglie raccolte Nota: La procedura esatta liofilizzazione descritta di seguito dipende dalla natura dell’apparato di liofilizzazione disponibili disponibile. Lyophilize le foglie raccolte fino a secco. Mettere le foglie raccolte in un sacchetto di polipropilene spessore mm 2. Congelare le foglie raccolte da memorizzare in un congelatore-80 ° C per 30 min. Bucherellate la borsa con molti piccoli fori utilizzando un pin. Posto l’insaccato congelato lascia nella camera centrale dei liofilizzatori. Garantire tutti i rubinetti di attaccamento pallone sono chiusi e poi accendere il liofilizzatori. Garantire il condensatore raggiunge almeno-50 ° C e la pressione si riduce di almeno 0,15 mbar e poi lasciare durante la notte. Spegnere i liofilizzatori e sfogare il vuoto aprendo un rubinetto di attaccamento pallone. Rimuovere le foglie secche da camera centrale e procedere al passaggio 7. 7. pressione di estrazione con solvente Nota: I passi del procedimento si riferiscono all’utilizzo di uno strumento PSE commercialmente disponibile (Vedi Tabella materiali). Consultare la documentazione del produttore per informazioni più dettagliate sul funzionamento. L’apparecchio esegue 4 estrazioni in parallelo. Macinare le foglie secche in una polvere di corso tramite un metodo conveniente (ad es., per la maggior parte dei composti triterpenici di interesse utilizzare un robot da cucina domestico, o manualmente schiacciare le foglie mentre contenute all’interno di un sacchetto).Nota: Rettifica con un pestello e mortaio sotto azoto liquido non è solitamente necessario. Mescolare la polvere di foglia con sabbia di quarzo (\u2012 0,3 0,9 mm, 20% in volume) in un contenitore adatto; Questo agisce come un disperdente e migliora l’efficienza del processo di estrazione. Preparare 4 celle di estrazione (120 mL) per il riempimento. Per questo, è necessario invertire le cellule di estrazione e inserire il filtro di fibra di vetro, seguita dalla fritta di metallo e tenendo la spina. Restituire le cellule di estrazione al montante posizione e versare uno strato profondo di 1 cm di sabbia di quarzo (\u2012 0,3 0,9 mm). Riempire le celle di estrazione. Riempire le celle di estrazione con la polvere di foglia preparato generata nel passaggio 7.1 fino alla linea di riempimento. Se necessario, comprimere delicatamente la polvere durante questo processo per facilitare l’aggiunta di una quantità maggiore in ogni cella di estrazione. Aggiungere un piccolo strato di sabbia di quarzo (\u2012 0,3 0,9 mm) nella parte superiore della polvere imballata e inserire il filtro di cellulosa superiore. Inserire le celle di estrazione imballato allo strumento PSE ed eseguire il metodo desiderato. Utilizzare le seguenti impostazioni e materiale; Solvente: 100% acetato di etile; temperatura: 100 ° C, pressione: 130 bar. Eseguire 3 cicli come segue: ciclo 1: 0 min tempo di attesa, ciclo 2 e 3: 5 minuti tempo di attesa, terminano con un flush di solvente 2 min e 12 min azoto gas a filo.Nota: Si consiglia di ottimizzare in primo luogo il metodo di estrazione su piccola scala. Tuttavia, il metodo seguente è spesso sufficiente per più ossidati agliconi triterpenici. Il liquore da ogni cella di estrazione possa essere combinato nel recipiente di raccolta esterno stesso specificando la linea dei rifiuti come la destinazione di estrazione, invece delle linee della collezione standard individuali. Essere consapevoli della quantità di solvente utilizzato è dipenda sull’imballaggio delle cellule estrazione e la temperatura impostata e la pressione. Il metodo di cui sopra in genere genera circa 800 mL di liquore di estrazione per 4 estrazioni parallele. Ripetere i passaggi 7.2 a 7.3.3 tutta la polvere di foglia è stato elaborato. Concentrare il liquore di estrazione unita alla secchezza, tramite evaporazione rotativo sotto vuoto. Verificare i risultati attesi (cioè, liquame verde scuro).Nota: L’esatta procedura può variare a seconda del set up dell’evaporatore rotante disponibile. Sempre indossare occhiali di protezione durante l’esecuzione di evaporazione rotativa e verifica cristalleria per danni prima di sottoporre a condizioni di vuoto. Accendere il riciclatore di refrigeratore e permettere al liquido di trasferimento di calore raffreddare per almeno 5 ° C. Accendere il bagno d’acqua e regolare la temperatura di 35 ° C. Trasferire il liquore di estrazione a un pallone di evaporazione (non riempire più di metà del volume del pallone). Concentrare il liquore per singoli batch (al pallone stesso) se il volume totale eccede questo limite. Collegare il pallone di evaporazione riempito al dotto del vapore dell’evaporatore rotante (sicuro con una clip congiunta). Regolare la posizione lift boccetta e l’angolo, in modo da immergere il fondo terzo del pallone di evaporazione del bagno di acqua a un angolo di circa 45 °. Avviare il pallone gira ad una velocità che comincia a diffondersi il liquore di estrazione fino alle pareti del pallone. Assicurarsi che il rubinetto di sfiato sia chiuso e cominciare a ridurre la pressione (con il regolatore della pompa del vuoto) fino a quando una flebo moderata è osservata fra la boccetta del condensatore e ricevitore.Nota: Non consentono il liquore di estrazione iniziare a bollire. In questo caso ridurre la forza del vuoto per portare la distillazione sotto controllo. Controllare e regolare la velocità di forza e spin vuoto come appropriato fino a quando tutto il solvente è evaporato. 8. base di scambio ionico della resina trattamento per la rimozione delle clorofille Nota: I quantitativi indicati nei passaggi seguenti si presuppongono un’originale scala di lavoro di 100 \u2012 150 piante. Passaggio 8 non è adatto per prodotti contenenti gruppi carbossilici o gruppi funzionali che sarebbe essere idrolizzati in circostanze di base come ad esempio gli esteri. Sciogliere l’estratto grezzo generato nel passaggio 7 in un minimo volume di etanolo. Aggiungere 50 mL di perle di resina di scambio ionico base (Vedi Tabella materiali) all’uscita del punto 7.1.1 e agitare a temperatura ambiente per 30 min.Nota: Non sostituire agitazione per l’uso di mescolatura apparato. Magnetico o meccanico sovraccarico mescolando possa compromettere l’integrità delle perle resina. Adatto agitazione può essere convenientemente ottenuto anche con lenta rotazione del pallone di reazione su un evaporatore rotante con il vuoto impostato a pressione atmosferica o disconnesso. Aggiungere un ulteriore 50 mL di perle di resina di scambio ionico base ogni 30 min fino a quando la reazione è andato fino al completamento; le perle di resina di scambio ionico base cambierà dal rosa di colore verde, e la fase liquida cambierà da verde ad arancione o un colore marrone oscuro a seconda della scala. In caso di dubbio che la reazione è andato a compimento, campione 0,5 mL del liquido. Filtrare il campione attraverso una piccola colonna di terra di diatomee e osservare il colore del filtrato; la reazione è solitamente completa all’interno di 1,5 h. Filtrare la miscela di reazione attraverso una breve colonna di terra di diatomee. Eseguire questa operazione tramite filtrazione sotto vuoto, o una colonna di cromatografia flash di vetro utilizzando mano soffietto per applicare la pressione. Se rallenta la velocità di filtrazione, disturbare la parte superiore del riquadro di terra di diatomee con una bacchetta. Raccogliere il filtrato. Sciacquare le perline di resine raccolti con etanolo, seguita da 1:1. etanolo: esano e, infine, esano. Utilizzare un volume di risciacquo sufficiente per risospendere le perline nella parte superiore della colonna di terra di diatomee. Combinare il filtrato dal punto 8.4 e risciacqui da passo 8,5 e concentrarsi ad essiccazione per evaporazione rotativo sotto vuoto. 9. iniziale frazionamento grezzo Nota: Il seguente metodo è in genere appropriato per agliconi triterpenici ossidato tipico e si avvale di uno strumento automatizzato di cromatografia flash. Consultare la documentazione del produttore per maggiori dettagli sull’operazione. Assorbire il prodotto grezzo generato nel passaggio 8 su gel di silice flash grado (dimensione dei pori: 60 Å, dimensione delle particelle: 35 \u2012 75 μm) per l’applicazione di una cartuccia di cromatografia flash attraverso la metodologia di carico a secco. Sciogliere il prodotto grezzo generato nel passaggio 8 in un volume minimo di adatto solvente organico. Garantire la completa dissoluzione.Nota: Diclorometano con l’aggiunta di poche gocce di metanolo è di solito una scelta appropriata di solvente. Svitare la parte superiore di una cartuccia di cromatografia flash preriempita 100 g (Vedi Tabella materiali) e rimuovere l’inserto per rivelare lo spazio di testa di carico a secco. Utilizzare lo spazio di testa per misurare il volume appropriato di gel di silice per carico a secco. Trasferire il volume misurato del gel di silice per carico a secco per la soluzione del prodotto grezzo, quindi rimuovere il solvente per evaporazione rotativo sotto vuoto.Nota: Il gel di silice deve restituire a una polvere a flusso libero. Verso la fine del processo di evaporazione delicato raschiare potrebbe essere necessario senza il gel di silice dal lato del pallone di evaporazione. Equilibrare la cartuccia di cromatografia flash 100 g a 100 mL/min con almeno 5 volumi di colonna di esano 100%, ma idealmente fino a bagnare completamente e uniformemente il contenuto della cartuccia. Il gel di silice di carico a secco preparato generato nel passaggio 9.1.3 per spazio di testa di carico a secco della cartuccia cromatografia flash equilibrato 100g, versando il trasferimento. Sospensione in esano e una pipetta bocca larga utilizzabile per facilitare il trasferimento di qualsiasi rimanente gel di silice di carico a secco. Il gel di silice di carico a secco trasferiti letto con esano di 100% per rimuovere l’aria dallo spazio di carico a secco testa bagnata. Eseguire il seguente metodo di cromatografia: solvente [A]: esano, solvente [B]: acetato di etile, portata: 100 mL/min, gradiente: 0% [B] 100% [B] oltre 3000 mL, raccolta: raccogliere tutti i, formato di frazione: 250 mL. Analizzare le frazioni di strato sottile (TLC) cromatografia8 o spettrometria della cromatografia-massa del gas (GC-MS)8e la concentrazione di secchezza fraction(s) contenente il composto di interesse tramite rotary evaporazione sotto vuoto. Eseguire a valle purificazione bene fino a quando non viene raggiunto il livello desiderato di purezza.Nota: Purificazione di bene a valle è interamente composto specifico e non è possibile fornire una procedura standardizzata (vedere la sezione di discussione).

Representative Results

Rendimenti tipici isolati dipendono dalla combinazione enzima/enzima sotto inchiesta, la stabilità chimica del composto di destinazione e come contestare il processo di purificazione è stato. Precedentemente abbiamo segnalato isolati rendimenti di β-amirina derivati dai nostri esperimenti di biosintesi combinatoria che vanno da 0,12 a 3,87 mg per grammo di N. benthamiana foglia polvere secca. Questi composti hanno variato ampiamente nel livello di ossidazione e incluso innaturale combinazioni di enzimi (Figura 3)8. Questo protocollo è utilizzato ordinariamente nel nostro laboratorio per produrre decine o centinaia di milligrammi di prodotto purificato per la caratterizzazione strutturale mediante spettroscopia NMR e saggi funzionali a valle. Abbiamo anche dimostrato l’utilità preparativa di questa piattaforma producendo 0,8 g del triterpene impalcatura β-amirina una purezza superiore al 98%. Questo esperimento 459 piante usate e rappresenta un rendimento isolato di 3,3 mg per grammo di a secco N. benthamiana foglia polvere8. Figura 1: riepilogo schematico. Rappresentazione schematica del processo sfruttando l’espressione transitoria degli enzimi biosintetici in foglia N. benthamiana per deviare endogene forniture di 2,3-oxidosqualene verso la produzione preparativa di nuovi prodotti ad alto valore triterpenici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: vuoto infiltrator costruzione e processo. un) Bespoke pianta titolare un’ala distaccata. b) Bespoke ali di titolare pianta attaccate. c) inversione e sommersione delle piante. d) inserimento del bagno infiltrazione. bagno e) infiltrazione nel posto all’interno della camera di infiltrazione. f) Complete infiltrator vuoto: pompa per vuoto (1) (2) collegamento dalla pompa alla valvola d’isolamento serbatoio serbatoio a vuoto vuoto (3) (4) collegamento tra serbatoio a vuoto e la valvola di aspirazione (5) manometro (6) aria di infiltrazione camera (7) Serbatoio vuoto di infiltrazione camera (8). g) rappresentante foglie da una pianta infiltrata con un costrutto di espressione per la proteina fluorescente verde (GFP) dopo la crescita post-infiltrazione di cinque giorni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: precedentemente segnalati risultati rappresentativi per la preparativa produzione di β-amirina derivati utilizzando questo protocollo8. Questa tabella è ordinata da rendimenti isolati. Colonne sono formattate in modo condizionale con indicazione di colore del valore relativo. Rosso = alto, verde = basso (anche se intermedio giallo). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Alto-attraverso-ha messo sottovuoto infiltrazione permette questo protocollo essere utilizzato ordinariamente nel nostro laboratorio per la produzione di preparativa del triterpene composti di interesse per varie applicazioni a valle. L’apparecchiatura di infiltrazione vuoto qui descritta è facilmente replicato. Aggiunta del serbatoio vuoto è consigliabile ridurre il tempo necessario per tirare il vuoto necessario, tuttavia è possibile riutilizzare semplicemente un forno sottovuoto non modificato come camera di infiltrazione. Proteggere la pompa del vuoto tramite aggiunta di un condensatore adatto è teoricamente sensata, ma nel nostro laboratorio abbiamo trovato questo per essere inutili.

Copertura di infiltrazione è compromessa se le foglie non sono completamente immersi nella sospensione di infiltrazione. Questo problema è ridotto al minimo, garantendo che il livello della sospensione raggiunge la superficie superiore del titolare all’impianto, e che il titolare di impianto è una misura stretta per il bagno di infiltrazione. Notare dalla Figura 2 che la superficie superiore del titolare pianta viene incassata al bagno infiltrazione quando in luogo. Questo avviene mediante pannelli sui bordi centrali del titolare che formano il punto di ancoraggio con la parte superiore del bagno infiltrazione. La sospensione di infiltrazione richiederà aggiunte periodiche per mantenere il livello di sospensione. Ciò si ottiene tramite l’aggiunta di sospensione di infiltrazione in eccesso per evitare riduzione graduale del OD600 nel corso di una grande infiltrazione batch-wise. Tuttavia, nelle nostre mani, sostituzione per acqua non sembra avere un effetto notevole sui rendimenti attesi su scala preparativa, anche se questo non è stato studiato quantità. Quante piante possono essere infiltrati da un lotto di sospensione di infiltrazione è ancora una questione aperta. Abbiamo ordinariamente infiltrarsi tra 100 e 200 piante con un unico batch di sospensione di infiltrazione. Inoltre, è normale per alcuni terreni a lisciviare nella sospensione infiltrazione nel corso del processo di infiltrazione. Questo non è stato trovato per avere un effetto notevole sull’efficacia di infiltrazione.

Durante la vendemmia è consigliabile (ma non critico) per raccogliere solo le foglie che si sono infiltrate (alcune foglie saranno cresciuta post-infiltrazione). Vendemmia selettiva impedisce la diluizione con tessuto improduttivo, che altrimenti sarebbe aumentare il rapporto di endogeno impurità rispetto al composto di interesse. Questo ha un impatto nominale sulla facilità di purificazione a valle e aumenta la scala di questi processi. Quando si utilizza tHMGR per aumentare la fornitura di precursore, un fenotipo necrosed è osservato spesso a sviluppare durante il periodo di crescita post-infiltrazione. Questo è normale e aiuta effettivamente la raccolta selettiva e il processo di essiccazione a valle. La polvere di foglia secca solitamente può essere conservata in un contenitore sigillato in un luogo fresco, asciutto e buio, ma idealmente in un essiccatore sotto vuoto. Questo dipende dalla stabilità del composto di interessati. Prestare attenzione se si sceglie di memorizzare in un congelatore a-80 ° C. Garantire che le secche foglie sono in un contenitore a tenuta stagna e il ritiro dall’ammasso, permetterà questo contenitore a temperatura ambiente prima dell’apertura. In caso contrario si comporterà Riumidificatore delle foglie, che ostacolano l’elaborazione a valle.

I passaggi di post-raccolta in questo protocollo sono forniti a scopo esemplificativo, e per aiutare quei ricercatori che hanno una limitata chimica pratica esperienza. Possono essere sostituiti per molte altre tecniche di estrazione/purificazione del prodotto naturale. Come spiegato nell’introduzione, PSE ha molti vantaggi, tuttavia la capitale costo dell’apparato PSE commercialmente disponibile può essere proibitivo, e non è essenziale. Il trattamento base di scambio ionico della resina è un metodo molto conveniente per sostituire la tradizionale saponificazione seguita da liquido/liquido di partizionamento. Tuttavia, non è adatto per prodotti contenenti gruppi carbossilici o gruppi funzionali che sarebbe essere idrolizzati in condizioni di base, come gli esteri. Questi prodotti dovrebbe essere mantenuto sulla resina base di scambio ionico. Tuttavia, esiste la possibilità di sfruttare questo per una cattura e rilascio procedura (non documentato qui). Dove saponificazione tradizionale sarebbe appropriato, trattamento di resina di scambio ionico base serve come una comoda alternativa. Il metodo di cromatografia descritto nel passaggio 9, è stato trovato per essere generalizzabile per i composti descritti nella Figura 3. Tuttavia, composti di maggiore polarità possono richiedere un lungo periodo di eluizione 100% acetato di etile. Con riferimento al punto 9.2, purificazione bene a valle è interamente composto specifico e dipende anche dalla scala. Ripetuti cicli di cromatografia flash su scala ridotta con gradienti ottimizzati, è solitamente sufficiente per raggiungere una purezza appropriata per analisi NMR. Su scala più ampia, la cristallizzazione è spesso una comoda alternativa. In casi difficili, preparativa o semi-preparatorio ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC) può essere impiegata a seconda la quantità desiderata di composto isolato. Esempi di processi di depurazione a valle per una gamma di composti rappresentante possono essere trovati altrove8.

Il protocollo attuale, come presentato qui, è usato ordinariamente nel nostro laboratorio e ha dimostrato l’utilità. Tuttavia, c’è ancora un ampio margine per un’ulteriore ottimizzazione della piattaforma espressione. Lavoro è in corso nel nostro laboratorio per studiare come ulteriore ingegneria via e controllo differenziale dei livelli di espressione della proteina potrebbe migliorare triterpene produzione ulteriormente, mentre la mediazione della tossicità per le cellule dell’ospite. C’è anche il potenziale per indagare la manipolazione del trasporto intracellulare sistemi20,21e la direzione di enzimi diversi compartimenti cellulari22,23, viali che potrebbero migliorare l’efficienza di più eventi di ossidazione. Potenziali benefici per modificare la morfologia sottostante degli organelli chiave potrebbero anche essere esplorati. Ad esempio, la sovraespressione del dominio della membrana di Arabidopsis thaliana HMGR è stata osservata per indurre l’ipertrofia del reticolo endoplasmico in piante24; un sito chiave per attività di CYP450. Questo protocollo è ideale per la produzione di milligrammo per quantitativi di grammo-scala di prodotti triterpenici e possa essere impiegato in un ambiente di ricerca per accedere composti per studio a valle (ad esempio, l’esplorazione sistematica di struttura-attività le relazioni e le indagini preliminari alle proprietà farmacodinamiche e farmacocinetiche di composti di interesse clinico guida). Tuttavia, la piattaforma è linearmente e scalabile in modo affidabile semplicemente aumentando il numero delle piante utilizzate e la praticità di espressione transitoria tramite agroinfiltrazione è stata dimostrata su scala industriale per la produzione di proteine farmaceutici 14, così ci è potenziale per questa piattaforma essere esteso per la produzione commerciale di alto valore triterpeni. In alternativa, è anche possibile prevedere la produzione di trasformanti stabile portando via biosintetica multigenica del desiderio finalizzato, che permette la coltivazione di massa e continuo ‘agricoltura’ di transgenici benthamiana N. ceppi produzione di mescole differenti di valore commerciale.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da un Norwich Research Park Studentship (JR), l’ingegneria congiunta e Physical Sciences Research Consiglio/biotecnologici e Biological Sciences Research Council BBSRC-finanziato centro ricerca biologia sintetica OpenPlant concedere (BB / L014130/1) (M.J.S., A.O.); un scambio di conoscenze di John Innes Centre e commercializzazione concedere (BB/KEC1740/1) (B.B.); e la concessione del programma strategico di BBSRC Istituto ‘Molecole dalla natura’ (BB/P012523/1) e la Fondazione di John Innes (A.O.). Vorremmo ringraziare George Lomonossoff per fornire i vettori pEAQ e Andrew Davis per la fotografia.

Materials

GC-MS instrument any n/a
Thermocycler suitable for performing PCR reactions any n/a
Gel electrophoresis apparatus any n/a
Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) any n/a
Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L) any n/a
Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/> 15000 rpm) any n/a
Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/> 4000 rpm) any n/a
Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/> 4000 rpm) any n/a
Standing incubator any n/a
Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L) any n/a
Centrifuge bottles (1 L) any n/a
Vacuum infiltration apparatus bespoke n/a
9 x 9 cm plant pots any n/a
Freeze drying apparatus (=/> 8 litre condenser capacity) any n/a
Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument) Buchi SpeedExtractor E-914
Rotary evaporator apparatus any n/a
Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L) any n/a
Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L) any n/a
Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L) any n/a
Spatulas (assorted sizes) any n/a
Analytical balance (5 figures) any n/a
Balance (2 figures) any n/a
Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L) any n/a
A -80 freezer any n/a
Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument Biotage ISO-1EW
Safety glasses any n/a
Lab coat any n/a
Autoclave any n/a
Consumables
Micropipette tips (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) any n/a
Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL) any n/a
Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL) any n/a
Disposable Transfer pipettes (size 2 mL) any n/a
Petri dishes (Size: 100 mL) any n/a
Biotage® SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges Biotage FSK0-1107-0100
HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps any n/a
Disposable purple nitrile gloves any n/a
Top filter for E-914, cellulose Buchi 51249
Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber Buchi 11055932
Reagents
Quartz sand, 0.3 – 0.9 mm Buchi 37689
Celite 545 (diatomaceous earth) Simga-Alrich 22140-1KG-F
Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm) Merck 1.09385.5000
2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid Melford B2002
MgCl2 Simga-Alrich 208337-100G
KOH Simga-Alrich 60377-1KG
3’5’-dimethoxy-4’-acetophenone (acetosyringone) Simga-Alrich D134406-1G
Rifampicin Alfa Aesar J60836
Kanamycin sulfate Gibco 11815-032
Streptomycin Simga-Alrich S6501-100G
Gentamycin MP biomedicals 190057
Agarose LE gel Melford MB1203
LB broth Millar Simga-Alrich L3522-250G
Agar Simga-Alrich A5306-250G
NaCl Simga-Alrich S5886-500G
KCl Simga-Alrich P9541-500G
MgSO4.7H2O Sigma-Alrich M2773-500G
Glucose Sigma-Alrich G7021-100G
Ambersep® 900 hydroxide (basic ion exchange resin) Sigma-Alrich 06476-1KG
Hexane Fisher H/0406/PB17
Ethyl acetate Fisher E/0900/PB17
Dichloromethane Fisher D/1852/PB17
Methanol Fisher M/4056/PB17
Ethidium bromide Sigma-Alrich E7637-1G
Ethanol VWR 20821-330
Milli-Q water any n/a
Levington F1 Compost any n/a
Levington F2 Compost any n/a
QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit). Qiagen 27104
NEB 5-alpha Competent E. coli Supplier New England Biolabs Ltd C2987I
pEAQ-HT-DEST1 vector Lomonossoff laboratory John Innes Center n/a
pDONR207 Thermo-Fisher pDONR207
A. tumefaciens LBA4404 Thermo-Fisher 18313015
GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) Thermo-Fisher 11791020
GATEWAY BP CLONASE ™ II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) Thermo-Fisher 11789020
GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX Promega UK Ltd M7822
PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE New England Biolabs Ltd M0530S
dNTP SET 100mm Thermo-Fisher 10297018
RNEASY PLANT MINI KIT Qiagen Ltd 74904
RQ1 RNASE-FREE DNASE Promega UK Ltd M6101
Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System Fisher 10308632
Trytone Sigma-Alrich T7293-250G
Nicotiana benthamiana seeds any reputable supplier n/a
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References

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Transient ExpressionNicotiana BenthamianaTriterpene ProductionPreparative ScaleAgrobacterium TumefaciensCo-infiltrationVacuum InfiltrationMMA BufferOD 600Preparative-scale AccessStructural CharacterizationMedicinally Relevant Biological ActivitySelective LB AgarSelective LB MediaCentrifugationResuspensionInfiltration Suspension

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Stephenson, M. J., Reed, J., Brouwer, B., Osbourn, A. Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale. J. Vis. Exp. (138), e58169, doi:10.3791/58169 (2018).
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