Transiente Expression in Nicotiana Benthamiana Blätter für Triterpene Produktion im präparativen Maßstab

Hinweis: Machen Sie vor Anschluss an dieses Protokoll sich vertraut mit den materiellen Sicherheitsdaten für alle Stoffe verwendet, und ergreifen Sie entsprechende Sicherheitsmaßnahmen. Dazu gehören aber sind nicht beschränkt auf: Schutzbrille tragen, bei der Arbeit mit Glas unter Vakuum und Umgang mit trockenen Silica-Gel in einem Laborabzug. Es ist auch wichtig, dass lokaler Gesetzgebung bezüglich Arbeit mit transgenen Material ist geprüft und beobachtet, darunter folgende geeignete Containment-Verfahren. 1. erzeugen Sie A. Tumefaciens Stämme für Infiltration Hinweis: Wir bieten hier eine vereinfachte Beschreibung der Schritte erforderlich, um geeignete A. Tumefaciens generieren Stämme für transiente Expression. Weitere Details dieser Schritte werden durch Sainsbury Et Al. beschrieben. 8. Verstärken durch PCR oder das Protein kodieren Region des Gens von Interesse, flankiert von 5′ und 3′ AttB Sequenzen geeignet für Generation ein Eintrag-Klon für den Einsatz mit einer ortsspezifische Rekombination Klonen Protokoll18,19zu synthetisieren. Forward Primer verwenden: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTANNNNNNNNNNNNNNNNNN, rückwärts-Primer: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTANNNNNNNNNNNNNNNNNN (NNNN… = Sequenz bestimmten Reihenfolge). (Vertreter) PCR-Bedingungen: Reaktion Mischung (25 µL, total), Puffer (5 X 5 µL, siehe Tabelle der Materialien), dNTPs (10 mM, 0,5 µL), Forward Primer (10 µM, 1,25 µL), rückwärts-Primer (10 µM, 1,25 µL), Template-DNA (Variable Konzentration, 50-250 ng, 0,5 µL ), DNA-Polymerase (2000 U/mL, 0,25 µL, siehe Tabelle der Materialien), Nuklease-freies Wasser (auf 25 µL). Führen Sie den Thermocycler wie folgt: erste Denaturierung (98 ° C, 30 s); Start Zyklus (98 ° C, 30 s; 45 – 72 ° C, 20 s; 72 ° C, 30 s/kb) Ende Zyklus; 35 Zyklen; letzte Erweiterung (72 ° C, 10 min). Folgen einer standard ortsspezifischen Rekombination Klonen Protokoll18,19 , einen Eintrag-Klon mit jedem nicht-Kanamycin-basierten Eintrag Vektor (wir verwenden pDONR207 die im Handel erhältlich ist) zu generieren.Hinweis: Die Integrität des Klons Eintrag sollte bestätigt werden, durch Sequenzierung, vor der Verwendung zu generieren die pEAQ -HT-DEST1 Ausdruck Konstrukt. Die pEAQ -HT-DEST1 steht auf Anfrage aus dem Lomonossoff-Labor an der John Innes Centre in Norwich, Großbritannien. Isolieren der pEAQ -HT-DEST1 Vektor vom Ausdruck Klon erstellt Schritt 1.1.3 und bei-20 ° C vor dem in Schritt 1.3 Gebrauch aufbewahren.Hinweis: Jedes handelsübliche bequem Spin spaltenbasierten Plasmid Reinigung Kit zur Gewinnung von Plasmiden aus Klonen Stämme von E. Coli ist geeignet. Folgen Sie die entsprechenden Anweisungen der gewählten Plasmid Reinigung kit (siehe Tabelle der Materialien). Transformation chemisch kompetente A. Tumefaciens vorbereiten. Eine selektive LB zu impfen (Luria-Bertani Medium: 10 g/L Bacto-Tryptone, 10 g/L NaCl und Hefeextrakt 5 g/L, Agar 10 g/L pH 7,0) nährbodenplatte (50 μg/mL Rifampicin, 100 μg/mL Streptomycin), von A. Tumefaciens LBA4404 aus einer Glycerin Lager Kultur Streifen. Über Nacht bei 28 ° C in einem ständigen Inkubator inkubieren. 50 mL der selektiven Flüssigmedien LB (50 μg/mL Rifampicin, 100 μg/mL Streptomycin) mit einer Stichprobe von A. Tumefaciens LBA4404 Zellen aus Schritt 1.2.1 zu impfen. Über Nacht bei 28 ° C in einem schütteln Inkubator bei 200 u/min inkubieren. Die Kultur von Schritt 1.2.2 für 10 min auf Eis abgekühlt und dann pellet A. Tumefaciens Zellen durch Zentrifugation bei 4 ° C und 4500 X g für 5 min (verwerfen der Überstand). Aufschwemmen der Pellets aus Schritt 1.2.3 in 1 mL eiskaltes 20 mM CaCl2 Wasserlösung und wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt von Schritt 1.2.3 (verwerfen der Überstand). Das Pellet aus Schritt 1.2.4 in 1 mL eiskaltes 20 mM CaCl2 Wasserlösung und aliquoten die entstandene Suspension in 50 µL Chargen aufzuwirbeln. Flash Einfrieren der Aliquote in Flüssigkeit N2 und speichern bei-80 ° C vor dem Gebrauch. Verwandeln die vorbereiteten A. Tumefaciens LBA4404 mit isolierten pEAQ -HT-DEST1 Vektor in Schritt 1.2 erzeugt. 50 µL A. Tumefaciens Aufhängung generiert in Schritt 1.2 auf Eis Auftauen und inkubieren Sie mit 100 \u2012 200 ng von isolierten pEAQ -HT-DEST1 Vektor, im Schritt 1.1, bei 0 ° C für 5 min generiert. Kälte Schock der inkubierten Suspension aus Schritt 1.3.1 in Flüssigkeit N2 für 30 s, dann auf Zimmertemperatur erwärmen lassen. Fügen Sie 200 μl SOC-Medium (SOC: 20 g/L Bacto-Tryptone, 5 g/L Hefeextrakt, 0,58 g/L NaCl, 0,19 g/L KCl, MgCl22,03 g/L, 2,46 g/L Magnesiumsulfat 7-Hydrat, 3,6 g/L Glukose) zu kalt schockiert Suspension aus Schritt 1.3.2 und 4 h bei 28 ° c inkubieren C in einem schütteln Inkubator bei 200 u/min. Eine selektive LB nährbodenplatte (50 μg/mL Rifampicin, 50 μg/mL Kanamycin, 100 μg/mL Streptomycin) mit der SOC-Kultur aus Schritt 1.3.3 zu impfen. Gründlich zu verbreiten, und 3 Tage bei 28 ° C in einem ständigen Inkubator inkubieren. 5 mL LB selektivmedien (50 μg/mL Rifampicin, 50 μg/mL Kanamycin, 100 μg/mL Streptomycin) mit einer einzigen Kolonie aus Schritt 1.3.4 zu impfen. Über Nacht bei 28 ° C in einem schütteln Inkubator bei 200 u/min inkubieren. Fügen Sie 200 μL des Glycerins zu 1 mL der flüssigen Kultur aus Schritt 1.3.5, gut durchmischen und bei-80 ° c LagernHinweis: Diese Kultur kann für zukünftige Experimente wiederbelebt werden, durch Schlieren auf LB-Agar-Platten mit geeigneten Antibiotika (siehe unten). 2. bereiten Sie Infiltration Suspension Eine selektive LB Agarplatte mit Streifen von der gewünschten impfen A. Tumefaciens Stämme aus dem Glycerin Lager Kulturen, die in Schritt 1 generiert. Über Nacht bei 28 ° C in einem ständigen Inkubator inkubieren.Hinweis: Eine Sorte mit tHMGR innerhalb einer pEAQ -HT-DEST1 Vektor kann auch aufgenommen werden. Einzeln impfen Sie 50 mL LB selektivmedien mit einer Probe von jedem A. Tumefaciens Stamm in Schritt 2.1 angebaut und über Nacht bei 28 ° C in einem schütteln Inkubator bei 200 u/min inkubieren. Individuell die 50 mL-Kulturen von Schritt 2.1.1 bis 1000 mL LB selektivmedien (Rifampicin 50 μg/mL, Kanamycin, 50 μg/mL Streptomycin 100 μg/mL) übertragen und über Nacht bei 28 ° C in einem schütteln Inkubator bei 200 u/min inkubieren. Individuell pellet A. Tumefaciens durch Zentrifugieren (4000 X g), der flüssige Kulturen im Schritt 2.1.2 (verwerfen der Überstand) erzeugt. Individuell Aufschwemmen der Pellets aus Schritt 2.1.3 in 50 mL frisch zubereitete MMA-Puffer (MMA Puffer: 10 mM 2-(N-morpholino)-Ethanesulphonic Säure, pH-Wert 5.6 (KOH), 10 mM MgCl2, 150 μM 3′ 5-Dimethoxy-4′-Acetophenon) und bei Raumtemperatur inkubieren im Dunkeln für 1 h. Kombinieren Sie das entsprechende Volumen jedes A. Tumefaciens MMA-Suspension (generierten im Schritt 2.1.4), eine endgültige OD600 von mindestens 0,2 für jede Belastung in 10 L endgültige Volumen zu produzieren. Die kombinierte Suspensionen in Schritt 2.1.5 zu einem Endvolumen von 1 L (Verwendung sofort in Schritt 3) erzeugt fügen Sie zusätzliche MMA Puffer hinzu.Hinweis: Es ist ratsam, eine zusätzliche 2 L Infiltration Suspension für die Aufrechterhaltung des Flüssigkeitsstand während der infiltrationsprozess vorzubereiten. Bereiten Sie 1 L 10 X Stärke MMA Puffer. 3. führen Sie Vakuum Infiltration Hinweis: Siehe Abbildung 2 eine Beschreibung der Vakuum Infiltration Apparatebau. Verwenden Sie 5 Wochen alten N. Benthamiana Pflanzen im 9 x 9 cm Töpfe für die Schritte des Verfahrens. Sämlinge sollten im F1 Kompost (z.B. aus Levington) gesät und für 2 Wochen vor der Übermittlung an einzelnen Töpfen mit F2 Kompost gewachsen. Pflanzen sollten in einem Gewächshaus bei 25 ° C, mit 16 h pro Tag von Licht (Verwendung von ergänzenden Beleuchtung bei Bedarf), Wasser täglich, Maximaldichte von 100 Pflanzen/m2angebaut werden. Übertragen Sie die 1 L Infiltration Suspension in Schritt 2 und 1 L 10 x Stärke MMA Puffer zum Infiltration Bad, gefolgt von einer zusätzlichen 8 L Wasser erzeugt. Entfernen Sie die abnehmbaren Flügeln des maßgeschneiderten pflanzenhalter, fügen Sie 4 Pflanzen (5 Wochen alten Pflanzen siehe vorhergehenden Anmerkung) und befestigen Sie wieder die Flügel. Invertieren des Inhabers und legen auf die Infiltration Bad um die Blätter in der Infiltration Suspension zu tauchen.Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Aussetzung die obere Fläche des die pflanzenhalter erreicht. Das Niveau mit dem Zusatz von zusätzlichen Infiltration Federung, bei Bedarf. Transfer der Infiltration Bad mit untergetauchten Pflanzen zur Infiltration Kammer und schließen Sie die Tür. Stellen Sie sicher, dass der Eindringling das Luft-Einlassventil geschlossen ist. Schalten Sie die Vakuumpumpe und öffnen Sie die Inline-Ventil, gefolgt von Vakuum Einlassventil auf die Infiltration Kammer Vakuum-Speicher. Sobald der Druck in der Kammer der Infiltration von 880 Mbar reduziert hat, schließen Sie das Vakuum Einlassventil und öffnen Sie das Luft-Einlassventil zu. Sobald die Infiltration Kammer auf den atmosphärischen Druck zurückgegeben hat, öffnen Sie die Tür, und entfernen Sie die Infiltration Bad. Die pflanzenhalter zu erhöhen, bis die Pflanzen nicht mehr in der Infiltration Suspension eingetaucht sind, dann schütteln die Halterung um überschüssige Aussetzung von den Blättern zurück in die Infiltration Wanne laufen lassen. Den Halter in die aufrechte Position zurück, entfernen Sie die abnehmbaren Flügeln und die Pflanzen sollten entfernt werden. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.1, 3.1.5, bis die gewünschte Anzahl von Pflanzen wurden infiltriert. Autoklaven der verwendeten Infiltration Suspension vor der Entsorgung. Autoklaven die Infiltration Bad vor der Wiederverwendung in späteren Experimenten. Das Innere der Kammer Infiltration durch Reinigung mit 70 % Ethanol zu sterilisieren und an der Luft trocknen vor der Wiederverwendung in späteren Experimenten lassen. 4. die infiltrierten Pflanzen wachsen Ordnen Sie die infiltrierten Pflanzen aus Schritt 3 bei einer maximalen Dichte von 100 Pflanzen/m2 in einem Gewächshaus. Für 5 Tage bei 25 ° C und 16 h pro Tag des Lichtes (verwenden Sie zusätzliche Beleuchtung bei Bedarf) und Wasser täglich wachsen. 5. die infiltrierten Blätter ernten Nach 5 Tagen Wachstum Ernte der Blätter. Autoklaven verschwenden Pflanzenmaterial, Töpfe und des Bodens vor der Entsorgung. 6. die geernteten Blätter trocknen Hinweis: Das unten beschriebene Verfahren genaue Lyophilisierung hängt von der Art der verfügbaren Gefriertrocknung Vorrichtung zur Verfügung. Die geernteten Blätter trocken lyophilize. Legen Sie die geernteten Blätter in einer 2 mm dicken Polypropylen-Tasche. Frieren Sie die geernteten Blätter durch die Speicherung in einer Gefriertruhe-80 ° C für 30 Minuten ein. Perforieren Sie die Tasche mit vielen kleinen Löchern, die mit einer Nadel. Ort der erlegten eingefroren verlässt in der zentralen Kammer die Gefriertrockner. Stellen Sie sicher, alle Kolben Anlage Wasserhähne geschlossen sind und schalten Sie dann den Gefriertrockner. Gewährleisten Sie der Kondensator erreicht mindestens-50 ° C und der Druck reduziert sich auf mindestens 0,15 Mbar zu, und lassen Sie über Nacht. Schalten Sie den Gefriertrockner und Entlüften Sie das Vakuum durch Öffnen einer Zapfstelle Kolben Anlage zu. Entfernen Sie die getrockneten Blätter aus der zentralen Kammer, und fahren Sie mit Schritt 7 fort. 7. unter Druck Solvent-Extraktion Hinweis: Die Verfahren Schritte beziehen sich um eine handelsübliche PSE-Instrument zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien). Entnehmen Sie bitte den Hersteller Literatur ausführlichere Informationen zum Betrieb. Das Gerät führt 4 Extraktionen parallel. Schleifen Sie die getrockneten Blätter zu einem Kurs Pulver über eine bequeme Methode (z. B. für die meisten Triterpene Verbindungen des Interesses inländischen im blitzhacker oder manuell Zerkleinern der Blätter, während in einem Beutel enthalten).Hinweis: Schleifen mit einem Stößel und Mörser unter flüssigem Stickstoff ist normalerweise nicht erforderlich. Das Blatt-Pulver mit Quarzsand (0,3 \u2012 0,9 mm, 20 % vol) in einem geeigneten Behälter; Dies fungiert als Dispergiermittel und verbessert die Effizienz der Extraktion. 4 Extraktion Zellen (120 mL) für die Füllung vorbereiten. Hierzu invertieren Sie die Extraktion Zellen und einsetzen Sie Glasfaser Filter, gefolgt von der Metall Fritten und halten Stecker. Zurück die Extraktion-Zellen, die die aufrechte position und fügen Sie eine 1 cm Tiefe Schicht Quarzsand (0,3 \u2012 0,9 mm). Füllen Sie die Extraktion Zellen. Füllen Sie die Extraktion Zellen mit den vorbereiteten Blattpulver im Schritt 7.1 bis zur Füllung Linie erzeugt. Bei Bedarf komprimieren Sie sanft das Pulver während dieses Prozesses, Aufnahme einen höheren Betrag in jeder Zelle der Extraktion zu erleichtern. Fügen Sie eine kleine Schicht Quarzsand (0,3 \u2012 0,9 mm) an die Spitze der verpackte Pulver und legen Sie den oberen Zellulose-Filter. Legen Sie die gepackte Extraktion Zellen in das PSE-Gerät und führen Sie die gewünschte Methode. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen und Material; Lösungsmittel: 100 % Ethylacetat; Temperatur: 100 ° C, Druck: 130 Bar. 3 Zyklen wie folgt ausgeführt: Zyklus 1: 0 min Haltezeit, Zyklus 2 und 3: 5 min Haltezeit, enden mit einem Lösungsmittel Flush 2 min und 12 min Stickstoff gas bündig.Hinweis: Es ist ratsam, zuerst die Extraktionsmethode in kleinem Maßstab zu optimieren. Die folgende Methode ist jedoch oft ausreichend für die meisten oxidierte Triterpene Aglycones. Der Schnaps aus jeder Extraktion-Zelle kann in der gleichen externen Auffanggefäß durch Angabe der abwasserlinie als Extraktion Ziel, anstatt die einzelnen Standardkollektion Linien kombiniert werden. Beachten Sie, dass die Menge des verwendeten Lösungsmittels die Verpackung der Extraktion Zellen und die eingestellte Temperatur und Druck abhängig ist. Die oben beschriebene Methode erzeugt in der Regel ca. 800 mL Extraktion Schnaps für 4 parallele Extraktionen. Wiederholen Sie die Schritte 7.2, 7.3.3, bis alle das Blattpulver abgearbeitet wurde. Die kombinierten Gewinnung Alkohol zu Trockenheit, über rotary Verdampfung unter Vakuum zu konzentrieren. Überprüfen Sie die erwartete Ausgabe (d.h. dunkel grün Gülle).Hinweis: Das genaue Verfahren variieren je nach eingestellter oben von den verfügbar drehverdampfer. Immer Schutzbrille beim Dreh Verdunstung durchführen, und überprüfen Sie Glaswaren für Schäden vor Vakuum-Bedingungen zu unterwerfen. Schalten Sie den Kühler-Recycler, und die Hitze Transfer Flüssigkeit auf mindestens 5 ° c abkühlen Schalten Sie das Wasserbad, und stellen Sie die Temperatur auf 35 ° C. Die Extraktion Schnaps auf ein verdampfungskolben übertragen (füllen Sie nicht mehr als die Hälfte des Volumens des Kolbens). Der Schnaps chargenweise zu konzentrieren (in in den gleichen Kolben) Wenn die dies übersteigt. Das Dampf-Rohr von der drehverdampfer (sicher mit einem gemeinsamen Clip) gefüllten verdampfungskolben beimessen. Passen Sie die Küvette Liftposition und Winkel, um den Boden tauchen der Verdunstung Flasche im Wasserbad bei Dritten eine ca. 45° Winkel. Starten Sie den Kolben dreht mit einer Geschwindigkeit, die beginnt, die Extraktion Schnaps an den Wänden des Kolbens zu verbreiten. Gewährleisten die Vent-Hahn geschlossen und fangen an, reduzieren Sie den Druck (mit dem Controller der Vakuumpumpe) bis moderate Tropf zwischen Kondensator und Empfänger Kolben beobachtet wird.Hinweis: Lassen Sie sich nicht die Extraktion Schnaps zu kochen beginnen. In diesem Fall verringern Sie die Stärke des Vakuums, die Destillation unter Kontrolle zu bringen. Überwachen Sie und passen Sie die Vakuum Stärke und Spin-Geschwindigkeit je nach Bedarf an, bis das Lösungsmittel verdampft ist. 8. Basis Ionenaustausch-Harz-Behandlung zur Entfernung der Chlorophylle Hinweis: Die Mengen, die in den folgenden Schritten zitiert übernehmen eine ursprüngliche arbeiten Skala von 100 \u2012 150 Pflanzen. Schritt 8 ist nicht geeignet für Produkte mit Carbonsäure-Gruppen oder funktionelle Gruppen, die unter Rahmenbedingungen wie Ester hydrolysiert werden würde. Auflösen der Rohöl-Extraktes in Schritt 7 in einem minimalen Volumen Ethanol erzeugt. Zugeben Sie 50 mL Basis Ionenaustausch harzkügelchen (siehe Tabelle der Materialien) an den Ausgang des Schritt 7.1.1 und schütteln bei Raumtemperatur für 30 min.Hinweis: Ersetzen Sie nicht für den Einsatz von rühren Gerät schütteln. Magnetische oder mechanischen Aufwand rühren kann die Integrität der Harz Perlen beeinträchtigen. Geeignete Erregung kann auch bequem mit dem Vakuum bei atmosphärischem Druck gesetzt oder getrennt durch langsame Rotation der Reaktionskolben auf einen drehverdampfer erreicht. Fügen Sie eine zusätzliche 50 mL Basis Ionenaustausch harzkügelchen alle 30 Minuten, bis die Reaktion vollständig erloschen ist; ändert sich die grundlegende Ionenaustausch-Harz-Perlen von Rosa in Grün in der Farbe und die flüssige Phase wechselt von Grün zu Orange oder eine trübe Farbe je nach Umfang. Probieren Sie im Zweifelsfall, die die Reaktion bis zur Fertigstellung gegangen, 0,5 mL der Flüssigkeit. Filtern Sie die Probe durch eine kleine Spalte mit Kieselgur und beobachten Sie die Farbe des Filtrats; die Reaktion ist in der Regel vollständig innerhalb von 1,5 Stunden. Filtern Sie das Reaktionsgemisch durch eine kurze Säule von Kieselgur. Führen Sie die Vakuumfiltration oder über eine Glassäule, Flash-Chromatographie mit Hand-Balg, Druck auszuüben. Wenn Filtrationsrate verlangsamt, stören Sie die Spitze des Kieselgur-Pads mit einem Rührstäbchen. Das Filtrat zu sammeln. Spülen Sie die gesammelten Harze Perlen mit Ethanol, gefolgt von 1:1 Ethanol: Hexan, und schließlich Hexan. Verwenden Sie eine Spülung Volumen ausreicht, um die Perlen auf der Oberseite der Spalte Kieselgur Aufschwemmen. Kombinieren Sie das Filtrat aus Schritt 8,4 und Spülungen aus Schritt 8,5 und konzentrieren Sie, Trockenheit von rotary Verdampfung unter Vakuum. 9. erste grobe Fraktionierung Hinweis: Die folgende Methode eignet sich in der Regel für typische oxidierte Triterpene Aglycones und automatisierte Flash-Chromatographie Instrument beschäftigt. Des Herstellers Literatur für weitere Details zur Bedienung finden Sie unter. Das Rohprodukt in Schritt 8 auf Flash-Grade Kieselgel generierten adsorbieren (Porengröße: 60 Å, Partikelgröße: 35 \u2012 75 μm) für die Anwendung auf eine Flash-Chromatographie-Patrone über trockene laden Methodik. Lösen Sie das Rohprodukt generiert in Schritt 8 in einem minimalen Volumen der organischen Lösungsmittel auf. Komplette Auflösung zu gewährleisten.Hinweis: Dichlormethan unter Zugabe von ein paar Tropfen von Methanol ist in der Regel eine geeignete Wahl des Lösungsmittels. Top 100 g vorgefüllten Flash-Chromatographie Kartusche abschrauben (siehe Tabelle der Materialien) und entfernen Sie das Einfügen, um den trockenen Kopf Laderaum zu offenbaren. Verwenden Sie den Kopfraum, um das entsprechende Volumen der Silica-Gel für trockene laden zu messen. Übertragen Sie das gemessene Volumen des Silica-Gel für trockene laden zur Lösung der Rohprodukt, dann entfernen Sie das Lösungsmittel durch rotary Verdampfung unter Vakuum.Hinweis: Das Silica-Gel sollte ein rieselfähiges Pulver wiederhergestellt. Gegen Ende der Verdunstung Prozess sanfte Kratzen muss gegebenenfalls die Silica-Gel von der Seite der verdampfungskolben frei. 100 g Flash-Chromatographie Patrone mit 100 mL/min mit mindestens 5 Spalte Volumen von 100 % Hexan, sondern im Idealfall Equilibrate, bis die Patrone Inhalt vollständig und gleichmäßig benetzt ist. Übertragen Sie die vorbereiteten trockenen laden Silica-Gel erzeugt im Schritt 9.1.3 zu den trockenen Kopf Laderaum der äquilibriert 100 g Flash-Chromatographie Patrone, Gießen. Federung in Hexan und einem breiten Mund Pipette kann verwendet werden, um Übertragung der alle verbleibenden trocken laden Silica-Gel zu unterstützen. Nassen übertragenen trocken laden Silica-Gel-Bett mit 100 % Hexan, Luft aus der trockenen laden Headspace entfernen. Führen Sie die folgende Methode der Chromatographie: Lösungsmittel [A]: Hexan, Lösungsmittel [B]: Ethylacetat, Durchfluss: 100 mL/min, Steigung: 0 % [B] bis 100 % [B] mehr als 3000 mL, Sammlung: sammeln Sie alle, Bruchteil Größe: 250 mL. Analysieren Sie die Brüche von Dünnschicht-Chromatographie (TLC)8 oder Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)8und Konzentration zu Trockenheit der Fraktion(en) mit der Verbindung von Interesse über rotary Verdampfung unter Vakuum. Durchführen Sie nachgeschalteten feine Reinigung, bis das gewünschte Maß an Reinheit erreicht ist.Hinweis: Nachgeschalteten feine Reinigung ist völlig zusammengesetzte spezifisch und es ist nicht möglich, standardisierte Schritte bieten (siehe Diskussion).