Imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula

1. imobilização de proteínas através de agentes de ligação de silano funcional Nota: A Figura 1 dá uma visão geral sobre a química de superfície aplicada no presente protocolo. Atenção: O seguinte protocolo, diferentes produtos químicos corrosivos e de pele irritante propriedades são usados. Usar luvas (ácido-resistente) adequadas, óculos e casaco de laboratório e sob a coifa ao preparar soluções a fim de evitar a inalação de vapores. Functionalization de superfícies de vidro e do cantilever de nitreto de silício com silano, agentes de acoplamento Remova a poeira grossa e contaminações das lâminas de vidro com isopropanol e precisão de fiapos de toalhetes e os slides de corte no tamanho desejado (opcional).Nota: Ao lado do vidro, a superfície sólida pode ser sílica, quartzo e óxidos de alumínio, cobre, estanho, titânio, ferro, cromo, zircônio, níquel e zinco.Atenção: As lâminas de corte pode causar bordas afiadas. O vidro desliza em um frasco de coloração cheio de ácido clorídrico (33% HCl) diluída com água bidestilada (ddH2O) 3-5% (v/v), fechar o frasco com tampa apropriada e coloque-o em um banho ultra-sônico para 90 min à temperatura ambiente.Nota: O frasco utilizado tem um diâmetro de 6 cm e um tamanho aproximado de 65-70 mL. Um volume adequado de HCl diluído para o pote é de 50 mL contendo 5 mL 33% HCl e 45 mL de DDQ2O. O HCl efetivamente remove íons metálicos não vinculativo, especialmente de sódio, potássio e cálcio e reduz o silício para produzir uma superfície de vidro saturada de hidroxila.Atenção: O HCl é corrosivo e irritante da pele. Luvas resistentes a ácidos adequados, óculos de segurança e laboratório casaco e trabalham sob a coifa enquanto se prepara a solução para evitar a inalação de vapores. Coloque o nitreto de silício AFM do modilhão sondas sobre uma lâmina de vidro limpa com a ponta virada para cima e irradiar com ultra violeta luz de cima pelo menos 90 min.Nota: Para a espectroscopia de força única molécula, cantilevers com uma constante de mola nominal de 0,01 a 0,1 N m-1 são adequados. Irradiação da superfície do cantilever com luz UV irá remover contaminantes orgânicos, principalmente substâncias gordas e renderizá-los hidrófilo em um lado. Se o outro lado está fortemente contaminado – que não deve ser o caso, ou se a consola sondas são usadas frescas fora do caixa dos fornecedores – pode afetar a medição SMFS. Uma limpeza completa do chip modilhão todo usando solução de piranha, que tem sido utilizada em muitos estudos34, pode ajudar.Atenção: A luz UV é prejudicial aos olhos; Portanto, irradiação das sondas do cantilever deve proceder em uma câmara impermeável luz de UV. Solução de piranha é altamente reativa e pode queimar a pele, papel e outros materiais orgânicos. Não utilize recipientes plásticos. Se colocados em pratos ou potes mesmo com pequenas quantidades de contaminações superficiais orgânicas (por exemplo, do uso anterior), ele pode reagir rapidamente. Substituir o ácido clorídrico do frasco de coloração com DDQ2O sem deixar que a superfície de vidro seco e coloque o frasco em banho de ultra-sons para outro 10 min. substituir a água duas vezes mais para 10 min respectivamente de corretamente lavar o clorídrico ácido. Entretanto, dissolver o ácido de polietilenoglicol de silano etoxi (ou metoxi) (Si (OC2H5)3-PEG-COOH) em uma mistura de etanol e ddH2O (v/v 95 5%, pH 4.6 ajustado com ácido acético) a uma concentração final de 0,1 mg mL -1. Armazene a solução hermeticamente fechada para evitar a evaporação do etanol.Nota: Agentes de acoplamento silano são sensíveis à umidade e temperatura. Portanto, eles devem ser armazenados sob gás inerte (N2), a baixa temperatura (-20 ° C) e sob condições de seca. Antes de abrir o frasco, certifique-se que os silanos chegaram a temperatura para minimizar a hidratação e, assim, passivação de determinados grupos. Agentes de acoplamento Heterobifunctional PEG estão disponíveis com numerosos espaçador de diferentes comprimentos e diferentes grupos funcionais. Para a imobilização aleatória de proteínas através de seus grupos aminoácidos livres (NH2), conforme descrito no presente protocolo, o grupo funcional adicional para o silano etoxi/metoxi devem ser um éster de NHS. Ao lado a compra de um agente silano com éster do NHS, uma maneira simples de ganhar tal éster de NHS é ativar um grupo carboxila (-COOH) com 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) e NHS (ver 1.2.1. e 1.2.2.).Atenção: O etanol é inflamável e irritante da pele. O ácido acético é inflamável e corrosivo. Tome cuidado para não pegar os silanos reativos na pele ou nos olhos. Usar luvas adequadas, óculos e casaco de laboratório e sob a coifa para evitar a inalação de vapores. Despeje a solução de silano em dois pratos de Petri separado, coloque o preparado do modilhão sondas e corrediças de vidro em uma placa de Petri, respectivamente, selar hermeticamente (por exemplo, parafilm) para evitar a evaporação do etanol e incubar estacionário durante 90 minutos a temperatura ambiente.Nota: O tamanho ideal da caixa de Petri depende do número de sondas do cantilever e o tamanho das lâminas de vidro que deve ser acrescida. Um tamanho de diâmetro para bom manuseio e volume de reagente baixa é 50-60 mm. Para evitar indesejáveis de dobra do cantilever enquanto penetrando através da interface de água do ar cantilever deve ser realizada em um ângulo de 90° para a interface ar-água. A incubação das lâminas de vidro (mas não as sondas do cantilever), opcionalmente, pode ser realizada em um agitador orbital. Lave os slides do cantilever e vidro em três copos consecutivos contendo etanol puro de ser completamente lavado os compostos de silano desacoplado.Nota: Para evitar indesejáveis de dobra do cantilever enquanto penetrando através da interface de água do ar, o cantilever deve ser realizado em um ângulo de 90°. Coloque as lâminas de vidro funcionalizados no frasco do coloração e o cantilever em uma lâmina de vidro limpa e cura a 110 ° C por 30 min.Nota: Cura com calor induz a formação de ligações covalentes siloxano e a remoção de água. Como as lâminas de vidro foram apenas acrescidas de um lado, certifique-se de indicar corretamente o lado revestido. Armazenar as amostras de vidro silanizadas e consola sondas num exsicador de vácuo para uma semana.Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Imobilização aleatória das proteínas em cantilever de nitreto de vidro e silicone silanizadasNota: Para evitar indesejáveis de dobra do cantilever, a sonda do cantilever deve ser mantida em um ângulo de 90° enquanto penetrando quaisquer interfaces ar-água. Prepare uma solução contendo 42 mg mL-1 de EDC e 20 mg mL-1 NHS no soro padrão tamponado de fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7,4).Cuidado: EDC é corrosivo e irritante da pele e pode causar danos oculares graves. Use luvas adequadas, óculos e casaco de laboratório. Cobrir as lâminas de vidro de silano revestido com a solução e colocar silanizada modilhão sondas em uma gota da solução de EDC/NHS e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.Nota: Para a incubação das sondas modilhão, caixa original do cantilever é adequada. A jovem proteínas através de seus grupos aminoácidos livres para os carboxyls (-COOH) dos agentes heterobifunctional silano-PEG, o grupo – COOH é ativado com a química EDC/NHS amplamente utilizada. EDC casais NHS ao ácido carboxílico, formando um éster de NHS “estável”, que permite eficiente conjugação de aminas primárias no pH fisiológico em um próximo passo. Enxague os slides do cantilever e vidro completamente com PBS em três copos consecutivos fim Lave completamente a EDC/NHS excessivo.Nota: Esta etapa de lavagem é fundamental como proteínas de ligação cruzada de lata EDC/NHS restantes e, assim, alterar a sua funcionalidade. Incubar as lâminas de vidro ativado com e sondas de cantilever em uma gota da solução da proteína desejada em uma câmara úmida à temperatura ambiente. O tempo de incubação e a concentração de proteína deve ser adaptado para atender aos requisitos do experimento. Em geral, uma concentração entre 0,5 a 1 mg mL-1 e incubação vezes de 30 min a 2 h são adequados para a maioria das proteínas. No caso de fibronectina (na lâmina de vidro) e proteína pilus-1 ponta RrgA (na consola), uma concentração molar de 1,5 µM e 3 µM, respectivamente e um tempo de incubação de 2 h são suficientes. Lavar as lâminas de vidro e o cantilever sondas completamente com PBS em três copos consecutivos para lavar as proteínas unbound. Saturar o éster de NHS restante com tris (hidroximetil)-aminomethan, colocando as pontas de prova em salino tris (TBS; 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6) por 20 min em temperatura ambiente.Nota: Este passo reduz indesejada acoplamento covalente de proteínas entre a superfície funcionalizada da ponta da AFM e o vidro, porque grupos aminoácidos de Tris podem vincular aos restantes grupos COOH registrados na superfície do cantilever e substrato. Lavar as lâminas de vidro e cantilever sondas completamente com PBS e loja-los em pratos de Petri separada cobertas de PBS até o uso.Nota: As amostras devem ser preparadas na hora e usada no mesmo dia. 2. microscopia de força atômica baseada única molécula espectroscopia de força Nota: Neste trabalho, um microscópio de força atômica de JPK Instruments foi usado e set ups para obtenção de curvas de força-distância foi definido com o RampDesigner de força. Calibração do cantilever com o ruído térmico método35Nota: Para a calibração do cantilever, siga o passo no manual do fabricante. A maioria do modilhão estado fornecedores uma constante aproximada de primavera, que é normalmente calculada da forma nominal do cantilever (comprimento, largura e espessura) e, portanto, não é muito confiável. Como a constante de mola correta é crucial, é aconselhável realizar a calibração do modilhão descrita abaixo em triplicado e usar os valores médios de sensibilidade óptica alavanca e primavera constante. Pode ser útil gravar a deflexão do cantilever em volts (V) durante o experimento e converter a força (pN) em seguida, usando a sensibilidade óptica alavanca e mola constante valores médios. A sensibilidade de alavanca óptica e constante de mola pode ser determinada antes ou após a experiência, enquanto a posição do laser não é alterada em cantilever (a posição do laser refletida pode ser reajustada sobre o fotodiodo). Corrigir uma lâmina de vidro limpa, fresca no suporte de amostra da AFM e cobri-lo com o tampão PBS.Nota: A calibração deve ser efectuada numa superfície dura (por exemplo, vidro) e a mesma reserva como as experiências reais. Fixar a sonda modilhão preparado o titular do cantilever, coloque-o na cabeça AFM e molhado com cuidado o cantilever com uma gota de tampão PBS.Nota: A molhadela do cantilever reduz a tensão superficial aparecendo durante a penetração no buffer PBS sobre a lâmina de vidro de calibração e dobrando-se desse modo indesejável do cantilever. Mova lentamente o cantilever em direção à superfície de calibração até o cantilever é completamente imerso no buffer PBS, mas ainda longe da superfície de calibração. Usar o microscópio ótico de vista superior do AFM ou (se disponível) o microscópio invertido debaixo do AFM para posicionar o laser do AFM na parte de trás do cantilever. Lugar perto do fim do cantilever perto onde se encontra a ponta do laser.Nota: O ponto do laser deverá situar-se perto do fim do cantilever, mas ainda deve estar completamente em cantilever. Se nenhum microscópio óptico estiver disponível, use um pedaço de papel para diodos laser visível ou um cartão de detector de laser para diodos laser infravermelho, colocá-lo debaixo da cabeça AFM e mover o ponto do laser em direção à borda do modilhão-chip, onde se situam os cantilevers , até que você vê a mancha no detector de papel ou de cartão. Em seguida, mova o laser paralela à borda. Quando a mancha desaparece, é que é um braço do cantilever. Para cantilevers lineares, mova o ponto no final do braço de alavanca, até que ele apareça no detector de papel/cartão e move-lo de volta até que seja novamente sobre o braço de alavanca (desaparece a partir do papel/cartão). Para triangular, coloque o ponto no meio entre dois braços do cantilever e movê-lo no final do cantilever, até desaparecer do papel/cartão. Verifique se você está no meio do cantilever, movendo o ponto perpendicular ao eixo longo do cantilever. Ajuste a posição do fotodiodo de detector quatro quadrantes do AFM de tal forma que o feixe de laser refletida é posicionado no centro do fotodiodo.Nota: Proceda do seguinte modo: Utilize os parafusos de micrômetro perto o diodo detector para mover o diodo na horizontal e no sentido vertical, até que o sinal de soma de todos os quatro quadrantes é maximizado. Em seguida, mover o diodo no sentido vertical, até que o sinal de deflexão vertical é zero e mover o diodo no sentido horizontal, até que o sinal de deflexão lateral é zero. Cantilevers de nitreto de silício geralmente têm um revestimento de ouro e, portanto, um bimetálico com dois diferentes coeficientes de expansão térmica. Isso resulta em uma deriva térmica (aparente no sinal de deflexão vertical) especialmente em solução. Para reduzir essa deriva durante as medições, deixe todo o sistema equilibrar por alguns minutos antes de iniciar a calibração. Abra o Gerenciador de calibração no software AFM e calibrar a sensibilidade do cantilever e a constante de mola do cantilever com o método de ruído térmico, como segue. Cuidadosamente, aproximar a superfície do substrato e gravar uma curva força-distância. Determine a sensibilidade de alavanca óptica em nm/V por encaixe uma linha reta até a parte mais íngreme da curva de força de retração, onde a ponta está em contacto com a superfície do substrato. A sensibilidade permite converter a constante de mola do cantilever para pN/nm.Nota: O declive da curva de retração é o piezo viajar distância vs. a mudança na tensão de fotodiodo (medida em nm/V). Grave vários espectros de ruído térmico do cantilever com o cantilever aproximadamente 100 µm ou mais longe da superfície, a fim de excluir qualquer superfície de amortecimento. Determine a constante de mola do cantilever em pN/V por um oscilador harmónico fornecido pelo software AFM para os espectros de ruído térmico de encaixe. Lentamente, retrair o cantilever e retirá-la da solução. Substituto a superfície de vidro usado para calibração do cantilever com a superfície da amostra contendo as proteínas imobilizadas. Certifique-se de que o cantilever e a superfície da amostra (e, assim, as proteínas) não seque enquanto mudando as lâminas de vidro. Força de interação experiências sobre o nível de proteína única Mova lentamente o cantilever úmido em direção à superfície da amostra até o cantilever é completamente coberto pelo tampão PBS, mas ainda longe da superfície do substrato.Nota: Para reduzir a deriva térmica durante o experimento, deixe todo o sistema definido por alguns minutos antes de iniciar as medições de espectroscopia de força. Aproximar a superfície e gravar várias curvas de força-distância (≥ 500) em diferentes locais da superfície da amostra, com uma força de contato de pN 250, um tempo de contato de 1 s, um comprimento de retração de 2 µm e uma velocidade de retração de 1 µm s-1.Nota: Para ajustes de espectroscopia de força geral, siga o manual do fabricante. Variações: A velocidade de retração pode ser variada entre 0,1 e 5 µm s-1 para calcular dados de cinética dependendo da carga de força crescente. O tempo de interação pode ser variado para analisar o reforço de vínculo dependente do tempo. Em vez de manter a velocidade de retração constante, pode-se manter a força constante (forçar modo de braçadeira). Análise de dadosNota: A análise dos dados foi realizada utilizando o software de processamento de dados. Dependendo das proteínas imobilizadas, o tempo de contato ou a velocidade de retração, se uma pegada foi incorporada ou não e outros parâmetros variáveis, as curvas de força-distância contêm várias informações diferentes. Interpretação e análise de dados podem variar muito entre diferentes experiências SMFS e, portanto, não podem ser descritos em detalhes aqui. Quanto a interação de RrgA e Fn, o seguinte protocolo pode ser um primeiro passo para a análise dos dados SMFS. Abra os arquivos de curva de força medidos, selecionando o ícone Open Batch de forçar digitalizar e processar as curvas força-distância da seguinte forma: Converta a deflexão do cantilever (V) para a força diretamente proporcional (F), selecionando o ícone de (Re) calibrar a V-deflexão por ajuste de sensibilidade e primavera constante .Nota: Se o cantilever calibração foi realizada antes do experimento, os valores são salvos nos arquivos de verificação de força e automaticamente são utilizados durante a calibração da V-deflexão. Se a calibração foi realizada após a experiência, o software usa os valores padrão, que podem ser alterados para os valores medidos. Subtrai a linha de base do canal de retração em uma região da curva força distante da superfície para definir o nível de força zero selecionando o ícone de Subtração da linha de base.Nota: Em alguns casos, a retração pode não ter o mesmo valor da força constante e a curva pode apresentar uma inclinação linear, que pode ser removida, selecionando Offset + inclinação. Defina o ponto onde a ponta entra em contato com a amostra, selecionando o ícone de Determinação de ponto de contato . Converta o sinal de altura para separação de ponta-amostra selecionando o ícone de Separação de ponta-amostra . Além de subtrair a posição do ponto de contacto, este procedimento subtrai cantilever curvatura para calcular a distância entre a superfície do substrato e AFM de ponta.Nota: Para a montagem de modelos de polímero elástico, como o modelo extensível de worm-tipo-corrente e a determinação de comprimentos de interação, é necessária a separação da ponta-amostra, que é corrigida para a dobra do cantilever. Para determinar a taxa de carregamento da inclinação da curva de força e a velocidade de z-piezo de força, as curvas de força não corrigida devem ser usadas. Tela os traços de força-distância para picos de força ocorrem em comprimentos de ruptura acima de 70 nm (comprimento do espaçador PEG esticado)36 resolver interações inespecíficas e aplicar o modelo extensível de worm-como-cadeia para os picos seleccionados, selecionando o Ícone de caber um modelo de cadeia do polímero e escolheu o Extensible modelo de cadeia do tipo Worm. Os picos na curva de força de retração serão equipados com este modelo, e as forças de ruptura e comprimentos são obtidos, juntamente com os parâmetros elásticos do polímero. Exiba os dados como histogramas, mostrando as distribuições de força e comprimento. Use pelo menos 100 eventos desvinculação para os histogramas.