Immobilizzazione covalente di proteine per la spettroscopia di forza di singola molecola

1. immobilizzazione delle proteine tramite agenti di accoppiamento funzionale Silano Nota: La Figura 1 fornisce una visione sopra la chimica di superficie applicata in questo protocollo. Attenzione: Nel protocollo seguente, vengono utilizzati prodotti chimici differenti con corrosivo e pelle irritante proprietà. Indossare adeguati guanti (resistenti agli acidi), occhiali di sicurezza e un camice da laboratorio e lavorare sotto la cappa durante la preparazione di soluzioni al fine di evitare l’inalazione dei vapori. Funzionalizzazione di superfici di vetro e a sbalzo di nitruro di silicio con agenti di accoppiamento del silano Rimuovere la polvere grossolana e contaminazioni da lastre di vetro con isopropanolo e privo di lanugine precisione wipes e tagliare le diapositive nella dimensione desiderata (opzionale).Nota: Al lato di vetro, la superficie solida può essere silice, quarzo e ossidi di alluminio, rame, stagno, titanio, ferro, cromo, zirconio, nichel e zinco.Attenzione: Le diapositive di vetro di taglio può causare bordi taglienti. Posto il vetro i vetrini in una vaschetta di colorazione riempita di acido cloridrico (33% HCl) diluito con acqua bidistillata (ddH2O) da 3-5% (v/v), chiudere il vasetto con coperchio appropriato e inserirlo in un bagno ad ultrasuoni per 90 min a temperatura ambiente.Nota: Il vaso utilizzato ha un diametro di 6 cm e una dimensione approssimativa di 65-70 mL. È un volume appropriato di HCl diluito per il vaso 50 mL contenente 5 mL 33% HCl e 45 mL di ddH2O. L’HCl efficacemente rimuove ioni metallici non vincolanti, soprattutto sodio, potassio e calcio e riduce il silicio per produrre una superficie di vetro saturato di idrossile.Attenzione: HCl è corrosivo e irritante della pelle. Indossare adeguati guanti resistenti agli acidi, occhiali di sicurezza e laboratorio cappotto e lavorare sotto la cappa mentre si prepara la soluzione al fine di evitare l’inalazione dei vapori. Posizionare il nitruro di silicio AFM a sbalzo sonde su un vetrino pulito con la punta rivolta verso l’alto e irradiare con luce dall’alto per almeno 90 min ultravioletta.Nota: Per spettroscopia della forza singola molecola, cantilever con una costante primavera nominale di 0.01-0.1 N m-1 sono adatti. Irradiazione della superficie a sbalzo con luce UV sarà rimuovere contaminanti organici, principalmente sostanze grasse e renderla idrofila su un lato. Se l’altro lato è fortemente contaminato – che non dovrebbe essere il caso, o se le sonde a sbalzo vengono utilizzate freschi fuori scatola dei fornitori – può colpire la misurazione di SMF. Una pulizia accurata del chip a sbalzo intero utilizzando la soluzione piranha, che è stato utilizzato in molti studi34, può aiutare.Attenzione: La luce UV è dannosa per gli occhi; quindi, irradiazione delle sonde a sbalzo dovrebbe svolgersi in un alloggiamento impermeabile luce UV. Soluzione piranha è altamente reattivo e può bruciare la pelle, carta e altri materiali organici. Non utilizzare contenitori in plastica. Se inserito in piatti o vasi anche con piccole quantità di contaminazioni superficiali organici (per esempio, dall’uso precedente), può reagire rapidamente. Sostituire l’acido cloridrico nella vaschetta di colorazione con ddH2O senza lasciare che la superficie di vetro asciutto e mettete il contenitore nel bagno ad ultrasuoni per un altro 10 min sostituire l’acqua due volte per 10 min rispettivamente a lavare correttamente il cloridrico acido. Nel frattempo, sciogliere etossi (o metossi) Silano polietilenglicole acido (Si (OC2H5)3-PEG-COOH) in una miscela di etanolo e ddH2O (v/v 95% / 5%, pH 4.6 regolato con acido acetico) ad una concentrazione finale di 0,1 mg mL -1. Conservare la soluzione sigillata ermeticamente per evitare l’evaporazione dell’etanolo.Nota: Agenti di accoppiamento del Silano sono sensibili all’umidità e temperatura. Di conseguenza, devono essere conservati sotto gas inerte (N2), a bassa temperatura (-20 ° C) e in condizioni di asciutto. Prima di aprire la muffola, assicurarsi che i silani hanno raggiunto la temperatura ambiente per ridurre al minimo idratazione e quindi passivazione dei gruppi reattivi. PEG eterobifunzionali agenti di accoppiamento sono disponibili con numerosi gruppi funzionali differenti e distanziale differenti lunghezze. Per casuale immobilizzazione di proteine tramite loro gruppi amminici liberi (NH2), come descritto in questo protocollo, il gruppo funzionale supplementare per il silano etossi/metossi devono essere un estere di NHS. Accanto l’acquisto di un agente silano con estere NHS, un modo semplice per ottenere tali estere NHS è quello di attivare un gruppo carbossilico (-COOH) con 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) e NHS (vedere 1.2.1. e 1.2.2.).Attenzione: L’etanolo è infiammabile e irritante della pelle. L’acido acetico è corrosivo e infiammabile. Fare attenzione a non per ottenere silani reattivi sulla pelle o negli occhi. Indossare adeguati guanti, occhiali e camice da laboratorio e lavorare sotto la cappa al fine di evitare l’inalazione dei vapori. Versare la soluzione di silano in due piatti separati di Petri, posizionare le sonde preparate a sbalzo e vetrini in una capsula di Petri rispettivamente, chiudere ermeticamente (ad es., parafilm) per evitare l’evaporazione dell’etanolo e incubare stazionario per 90 min a a temperatura ambiente.Nota: La dimensione ottimale del piatto Petri dipende il numero di sonde a sbalzo e le dimensioni delle diapositive di vetro che dovrebbe essere funzionalizzati. Una dimensione di diametro per buona maneggevolezza e reagente basso volume è 50-60 mm. Per evitare di piegare indesiderato del cantilever, penetrando attraverso l’interfaccia di acqua aria cantilever dovrebbero tenersi verso l’interfaccia acqua-aria con un’angolazione di 90°. L’incubazione i vetrini (ma non le sonde a sbalzo) può essere trasportato su agitatore orbitale. Sciacquare i vetrini a sbalzo e vetro in tre consecutivi becher contenente etanolo puro per lavare completamente i composti di silano non associato.Nota: Per evitare flessioni indesiderate del cantilever, penetrando attraverso l’interfaccia di acqua aria, il cantilever dovrebbe tenersi ad un angolo di 90°. Posizionare i vetrini funzionalizzati nella vaschetta di colorazione e il a sbalzo su un vetrino pulito e la cura a 110 ° C per 30 min.Nota: Curare con il calore induce la formazione di legami covalenti silossano e la rimozione dell’acqua. Come i vetrini sono stati funzionalizzati solo da un lato, assicuratevi di indicare correttamente il lato patinato. Conservare i campioni di vetro silanizzata e a sbalzo sonde in un essiccatore sotto vuoto fino ad una settimana.Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Casuale immobilizzazione delle proteine su cantilever di nitruro di silicio e vetro silanizzataNota: Per evitare di piegare indesiderato dello sbalzo, la sonda a sbalzo dovrebbe tenersi ad un angolo di 90°, penetrando tutte le interfacce aria-acqua. Preparare una soluzione contenente 42 mg mL-1 di EDC e 20 mg mL-1 NHS in tampone standard di fosfato salino (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mm Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4).Attenzione: EDC è corrosivo e irritante della pelle e può causare gravi lesioni oculari. Indossare adeguati guanti, occhiali e camice da laboratorio. Coprire i vetrini Silano rivestito con la soluzione e mettere silanizzata a sbalzo sonde in una goccia della soluzione EDC/NHS e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.Nota: Per l’incubazione delle sonde a sbalzo, la scatola originale a sbalzo è adatta. Per accoppiare proteine tramite loro gruppi amminici liberi ad il carboxyls (-COOH) degli agenti Silano-PEG eterobifunzionali, il gruppo – COOH è attivato con la chimica EDC/NHS ampiamente usata. EDC coppie NHS per l’acido carbossilico, formando un estere NHS “stabile” che permette di coniugazione efficiente di ammine primarie a pH fisiologico in un passaggio successivo. Sciacquare i vetrini a sbalzo e vetro accuratamente con PBS in tre bicchieri consecutivi al fine di lavare completamente eccessivo EDC/NHS.Nota: Questa fase di lavaggio è critica come rimanenti può crosslink proteine EDC/NHS e quindi alterare la loro funzionalità. Incubare i vetrini attivati con e il cantilever sonde in una goccia della soluzione della proteina desiderata in una camera umida a temperatura ambiente. Il tempo di concentrazione e l’incubazione di proteina dovrebbe essere adattato per soddisfare i requisiti dell’esperimento. In generale, una concentrazione tra 0,5 e 1 mg mL-1 e incubazione volte da 30 min a 2 h sono adatti per la maggior parte delle proteine. Nel caso di fibronectina (su lastra di vetro) e punta pilus-1 proteina RrgA (su cantilever), una concentrazione molare di 1,5 µM e 3 µM, rispettivamente e un tempo di incubazione di 2 h sono sufficienti. Lavare i vetrini e cantilever sonde accuratamente con PBS in tre bicchieri consecutivi al fine di lavare via proteine non associati. Saturare l’estere NHS rimanente con tris (idrossimetil)-aminomethan posizionando le sonde in soluzione fisiologica tamponata (TBS; 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.6) per 20 min a temperatura ambiente.Nota: Questo passaggio riduce indesiderato accoppiamento covalente di proteine tra la superficie funzionalizzata della punta dell’AFM e il vetro, perché gruppi amminici di Tris possono associare ai rimanenti gruppi COOH attivati sulla superficie a sbalzo e substrato. Lavare i vetrini e cantilever sonde accuratamente con PBS e store li in piatti separati Petri coperto in PBS fino all’utilizzo.Nota: I campioni devono essere preparati fresca e utilizzato lo stesso giorno. 2. atomic Force Microscopy base singola molecola spettroscopia della forza Nota: In questo lavoro, è stato utilizzato un microscopio a forza atomica di JPK Instruments e il set up per ottenere curve di forza-distanza è stata definita con il RampDesigner di forza. Calibrazione a sbalzo con il metodo di rumore termico35Nota: Per la calibrazione a sbalzo, seguire il passo nel manuale del produttore. La maggior parte a sbalzo stato fornitori una costante primavera approssimativa, che è di solito calcolata dalla forma nominale a sbalzo (lunghezza, larghezza, spessore) e pertanto non è molto affidabile. Come la costante elastica corretta è fondamentale, si consiglia di effettuare la calibrazione a sbalzo descritta di seguito in triplice copia e utilizzare i valori medi di sensibilità ottica leva e costante elastica. Può essere utile registrare la deflessione a sbalzo in volt (V) durante l’esperimento e convertire a forza (pN) in seguito, con la sensibilità ottica leva e molla costante valori medi. La sensibilità di leva costante ed ottiche di primavera può essere determinata prima e/o dopo l’esperimento, fino a quando non viene modificata la posizione di laser su cantilever (la posizione del laser riflessa può essere riadattata il fotodiodo). Difficoltà un vetrino pulito, fresco il supporto del campione AFM e coprirlo con il tampone PBS.Nota: La calibrazione deve essere effettuata su una superficie dura (ad esempio, vetro) e nello stesso buffer come esperimenti reali. Difficoltà la sonda a sbalzo preparati presso il titolare a sbalzo, posizionarlo nella testa del AFM e accuratamente bagnato il cantilever con una goccia di tampone PBS.Nota: La bagnatura del cantilever riduce la tensione superficiale che appaiono durante la penetrazione nel buffer di PBS sul vetrino di calibrazione e quindi indesiderabile di piegamento del cantilever. Spostare lentamente il cantilever verso la superficie di calibrazione fino a quando il cantilever è completamente immerso nel buffer di PBS, ma ancora lontano dalla superficie di calibrazione. Utilizzare il microscopio ottico di vista superiore del AFM o (se disponibile) il microscopio invertito sotto l’AFM per posizionare il laser di AFM sul retro del cantilever. Posto vicino alla fine del cantilever vicino dove si trova la punta del laser.Nota: Il punto del laser deve essere posizionato vicino all’estremità del cantilever, ma dovrebbe essere ancora completamente il cantilever. Se nessun microscopio ottico è disponibile, utilizzare un pezzo di carta per diodi laser visibili o una carta di rilevatore laser per diodi laser a infrarossi, metterlo sotto la testa AFM e spostare il punto di laser verso il bordo del cantilever-chip, dove si trovano i cantilever , fino a quando vedrete il posto sulla scheda di carta o rivelatore. Poi spostare il laser parallelo al bordo. Quando la macchia scomparirà, è su un braccio a sbalzo. Per cantilever lineare, spostare il punto verso la fine del braccio di leva finché viene visualizzata sulla scheda carta/rivelatore e sposta indietro fino a quando è di nuovo il braccio della leva (scompare dalla carta/card). Per triangolare, posizionare il punto a metà tra due braccia del cantilever e spostarla verso la fine del cantilever, fino a scomparire dalla carta/card. Verificare che siete nel bel mezzo dello sbraccio spostando il punto perpendicolare all’asse longitudinale del cantilever. Regolare la posizione del fotodiodo rilevatore quattro quadranti di AFM in modo tale che il raggio laser riflesso è posizionato al centro del fotodiodo.Nota: Procedere come segue: utilizzare le viti micrometriche vicino il diodo rivelatore per spostare il diodo in orizzontale che in senso verticale, fino a quando il segnale di somma da tutti e quattro i quadranti è ingrandito. Quindi spostare il diodo in direzione verticale, fino a quando il segnale di deflessione verticale è pari a zero e spostare il diodo in direzione orizzontale, fino a quando il segnale di flessione laterale è zero. Cantilever di nitruro di silicio solitamente hanno un rivestimento in oro e quindi sono un bimetallo con due diversi coefficienti di dilatazione termica. Ciò provoca una deriva termica (apparente del segnale di deflessione verticale) specialmente in soluzione. Per ridurre questa deriva durante le misurazioni, lasciate che l’intero sistema equilibrare per pochi minuti prima di iniziare la taratura. Aprire il gestore di calibratura del software AFM e calibrare la sensibilità a sbalzo e la costante elastica del cantilever con il metodo di rumore termico come segue. Attentamente la superficie del substrato si avvicinano e registrare una curva forza-distanza. Determinare la sensibilità della leva ottica in nm/V inserendo una linea retta alla parte più ripida della curva di forza di ritrazione, dove la punta è a contatto con la superficie del substrato. La sensibilità consente di convertire la costante della molla a sbalzo a pN/nm.Nota: La pendenza della curva di ritrazione è il piezo viaggia distanza vs. la variazione di tensione del fotodiodo (misurata in nm/V). Registrare diversi spettri di rumore termico del cantilever con il cantilever circa 100 µm o più lontano dalla superficie al fine di escludere qualsiasi superficie smorzamento. Determinare la costante elastica del cantilever in pN/V inserendo un oscillatore armonico fornito dal software AFM per gli spettri di rumore termico. Lentamente ritrarre il cantilever e ritirarlo dalla soluzione. Sostituto la superficie del vetro usato per la calibrazione a sbalzo con la superficie del campione contenente le proteine immobilizzate. Assicurarsi che la trave a mensola e la superficie del campione (e quindi le proteine) non a secco mentre si cambia i vetrini. Interazione della forza esperimenti a livello di singola proteina Spostare lentamente l’umido a sbalzo verso la superficie del campione fino a quando il cantilever è completamente coperto da tampone PBS, ma ancora lontano la superficie del substrato.Nota: Per ridurre la deriva termica durante l’esperimento, lascia l’intero sistema impostare per pochi minuti prima di iniziare le misure di spettroscopia di forza. La superficie si avvicinano e registrare più curve di forza-distanza (≥ 500) alle posizioni differenti della superficie del campione, con una forza di contatto di pN 250, un tempo di contatto di 1 s, una lunghezza di ritrazione di 2 µm e una velocità di retrazione di 1 µm s-1.Nota: Per registrazioni di spettroscopia di forza generale, seguire il manuale del produttore. Variazioni: La velocità di retrazione può essere variata tra 0,1 e 5 µm s-1 per calcolare cinetica dei dati a seconda del carico di forza crescente. Il tempo di interazione possa essere variato per analizzare il tempo dipendente bond rafforzamento. Invece di mantenere costante la velocità di retrazione, uno può mantenere costante la forza (forza morsetto modalità). Analisi dei datiNota: L’analisi dei dati è stato effettuato utilizzando il software di elaborazione dati. A seconda delle proteine immobilizzate, il tempo di contatto o la velocità di retrazione, se un’impronta è stata costituita o non e altri parametri variabili, le curve di forza-distanza contengono più informazioni diverse. Interpretazione e analisi dei dati può variare notevolmente tra diversi esperimenti di SMF e pertanto non può essere descritto in dettaglio qui. Per quanto riguarda l’interazione di RrgA e Fn, il seguente protocollo può essere un primo passo per l’analisi dei dati di SMF. Aprire i file di curva di forza misurata selezionando l’icona Apri Batch di scansione forza ed elaborare le curve forza-distanza come segue: Convertire la deflessione a sbalzo (V) alla forza direttamente proporzionale (F) selezionando l’icona di (Re) calibra la V-deflessione di regolazione sensibilità e primavera costante .Nota: Se a sbalzo calibrazione è stata effettuata prima dell’esperimento, i valori vengono salvati in file di scansione di forza e vengono utilizzati automaticamente durante la calibrazione della V-deflessione. Se la calibrazione è stata effettuata dopo l’esperimento, il software utilizza i valori predefiniti, che possono essere cambiati ai valori misurati. Sottrarre la linea di base del canale retrazione in una regione della curva forza lontano dalla superficie per impostare il livello di forza zero selezionando l’icona Sottrazione della linea di base.Nota: In alcuni casi, la retrazione non può avere lo stesso valore di forza costante e la curva potrebbe essere visualizzato un tilt lineare, che può essere rimosso selezionando Offset + Tilt. Definire il punto dove la punta diventa a contatto con il campione selezionando l’icona di Determinazione di punto di contatto . Convertire il segnale di altezza di separazione del suggerimento-campione selezionando l’icona di Separazione del suggerimento-campione . Oltre a sottrarre la posizione del punto di contatto, questa procedura sottrae il cantilever flessione per calcolare la distanza tra la superficie del substrato e AFM-tip.Nota: Per il montaggio di modelli elastici di polimero, come l’estensibile modello a vite senza fine-come-catena e la determinazione delle lunghezze di interazione, la separazione del suggerimento-campione, che è stato corretto per la curvatura a sbalzo, è necessario. Per determinare la forza tasso di carico dalla pendenza della curva di forza e la velocità di z-piezo, le curve di forza non corretta devono essere utilizzate. Schermo le tracce di forza-distanza per picchi di forza che si verificano a lunghezze di rottura sopra 70 nm (lunghezza del distanziale PEG allungato)36 per risolvere interazioni non specifiche e applicare il modello di vite senza fine-come-catena estensibile alle vette selezionate selezionando il Icona di un modello di catena di polimeri in forma e ha scelto l’ estensibile modello catena Worm-like. I picchi della curva di forza di retrazione saranno dotati di questo modello e forze di rottura e lunghezze sono ottenute, insieme con i parametri elastici del polimero. Visualizzare i dati come istogrammi mostrando le distribuzioni di forza e lunghezza. Utilizzare almeno 100 eventi non vincolanti per gli istogrammi.