カフェイン抽出、酵素活性、植物細胞懸濁液からのカフェイン合成酵素の遺伝子発現
Summary
このプロトコルは、抽出と成木L の細胞懸濁液中のカフェインの定量のための効率的な方法論と表現レベルのカフェイン合成酵素の酵素活性を評価するための実験的プロセスについて説明します。この酵素を符号化する遺伝子。
Abstract
カフェイン (1,3,7-トリメチルキサンチン) はコーヒーやお茶など人気のある飲み物でプリン アルカロイドです。この二次代謝産物は、抗菌作用があり、自然な殺虫剤であるので化学防衛とみなされます。カフェインは、周囲の植物の成長を防ぐ負のアレロパシー効果を生成できます。さらに、世界中の人々 はその鎮痛剤と促進の効果のためのカフェインを消費します。ためにカフェインの技術のアプリケーションの関心は、この化合物の生合成経路の研究は成長しています。これらの研究は、カフェインの生合成を調節する生化学的および分子メカニズムの理解に主に焦点を当てています。体外培養は、この生合成経路を研究するための便利なシステムになっています。この記事は、その活動と同様、l. c. のアラビカ種の細胞懸濁液にカフェインの定量化のためのカフェイン合成酵素 (CS) をエンコード (CCS1) 遺伝子の転写レベルを測定手順プロトコルを説明します。
Introduction
カフェインは、コーヒーノキ1属の植物によって生合成される二次代謝産物です。このアルカロイドはメチルキサンチンのファミリーに属するし、は病原体と植食者の2,3の悪影響に対して振舞うことだから化学プラント防衛とみなされます。さらに、この代謝物は、コーヒーを飲む、一般的に消費されて世界4,5である刺激的な特性を担います。その特性のためいくつかの研究グループは、生合成経路とカフェイン6、7の異化作用の勉強に興味があります。現在、植物培養細胞・組織培養は、様々 な生物的・非生物的戦略8,9カフェイン蓄積の評価のための代替として機能します。
カフェイン合成には順序N続く対応するリボース ヌクレオシドから 7 メチルキサンチンの加水分解のリリースが含まれます-3 と 1 の位置でメチル化。特定Ss-アデノシルメチオニン (SAM)-依存 N-メチルトランスフェラーゼ (NMT) に対し位置 7、メチル化を触媒するテオブロミン合成酵素 (TS) CS が関与しているの 3-、1-メチル化、それぞれ、テオブロミンを生産し、カフェイン。明確な NMTs をコードする遺伝子の研究は、カフェイン生産10,11を調節するメカニズムを理解することを許可しています。N-メチルトランスフェラーゼ活性である CS カフェイン11の生合成経路の最後の 2 つのステップを触媒します。コーヒーの木の苗の光放射がカフェイン生合成の増加で起因する CS 活動を増やすことができますが示されています。最近では、光照射下で、成木L. 細胞懸濁液の保守がカフェイン8の生合成経路に影響を与える非生物的ストレス要因を作り出す効果を評価するための最適な条件であることを示した。これらの研究で得られた情報は、このような培養システムでカフェインの生合成経路の研究を最大化するため代謝工学とシステム生物学のアプリケーションにあります。
アラビカの c. l. の細胞懸濁液にカフェインの抽出条件を最適化カフェイン生合成の研究のための適切なモデルを得ることの利点を考えると、また、コーヒーノキカフェイン合成酵素 1 (CCS1) この酵素の遺伝子転写のレベルを評価するための方法論的手順と同様に、酵素活性を研究するための有用なプロトコルを開発することが可能だった。症例を抽出し、薄層クロマトグラフィー (TLC デンシトメトリー) デンシトメトリーによって成木細胞懸濁液にカフェインを定量化するためのプロトコル。
Protocol
Representative Results
Discussion
カフェイン コンテンツを評価するための最適の条件をここで提案する、CS 活動とトラン スクリプト レベルの体外植物ティッシュ文化、成木の細胞懸濁液など。以前のレポートは、カフェイン成分分離手法を評価することが可能となって、カフェインのレベルを高めるための適切なパラメーターを維持する細胞と培養液中のテオブロミンの存在下で光照射下におけるには確認し?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
当研究室の仕事は、SMTHS に国立ナシオナル デ サイエンス y テクノロジー (CONACyT 219893) からの助成金によって賄われていた。この研究も、CONACyT、システマー ナシオナル ・ デ ・ Investigadores (4422) で RJPK (号 37938) に与えられる奨学金によって支えられました。著者は、この原稿の執筆の間に、そのインストールの使用のため CIATEJ をありがちましょう。特別な感謝は、この記事の撮影中に施設の分子生物学セクションとバレンティン メンドーサ ・ ロドリゲス、IFC、UNAM のすべての推薦の博士ビクター マヌエル ・ ゴンサレス ・ メンドーサまで延長されます。
Materials
| Murashige & Skoog Basal salt mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1) |
| Caffeine | SIGMA | C0750-5G | STANDARD-5g |
| Theobromine | SIGMA | T4500 | 20 g |
| CAMAG TLC Scanner-4 | CAMAG | 27.62 | |
| WinCATS Planar Chromatography Manager software | CAMAG | 1.4.10 | Software |
| Isoamyl alcohol (24:1) | SIGMA | C-0549 | 500 mL |
| Cyclohexane | JALMEX | C4375-13 | 1 L |
| Acetone | J.T. BAKER | 900643 | 4 L |
| Methanol | J.T. BAKER | 9093-03 | 4 L |
| Chloroform | JALMEX | C-4425-15 | 3.5 L |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | 1.05554.0001 | TLC plate |
| β-mercaptoethanol | M6250 | SIGMA | 100 mL |
| (+)-sodium L- ascorbate | A4034 | SIGMA | 100 g |
| Trizma base | SIGMA | T6066 | 1 Kg |
| Hydrochloric acid 36.5-38% | J.T. Baker | 9535-05 | 2.5 L |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 232227 | Kit |
| Methyl [3H]-S-adenosyl methionine | Perkin Elmer | NET155 | Specific activity of 15 Ci/mmol |
| Liquid scintillation vials | SIGMA | Z253081 | |
| Thermostatic bath/circulator | Cole Parmer | 60714 | |
| Micro centrifugue tube | Eppendorf | Tube of 1.5 mL | |
| Cryogenic vials | Heathrow Scientific | HS23202A | 2 mL |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf | 5804 000925 | |
| Vortex | Thermolyne | LR 5947 | |
| Porcelain mortar | Fisherbrand | FB961B | |
| Filter paper | Whatman | Z274844 | Porosity medium |
| Picofuge | Stratagene | 400550 | 2000 x g |
| Analytical balance | AND | HR-120 | Model HR-120 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | 6500 | |
| Gel photodocumentation system | Bio-Rad | Chemic XRS | Model Chemic XRS |
| Compact UV lamp | UVP | 95002112 | UVGL-25 |
| Scienceware HDPE Buchner funnel | SIGMA | 2419907 | Type 37600 mixer |
| TRIzol reagent | Thermo scientific | 15596-018 | 200 mL |
| ReverdAid Reverse transcriptase | Thermo scientific | #EP0441 | 10000 U |
| Oligo (dT)18 primer | Thermo scientific | #S0131 | 100 µM |
| DNase I, RNase-free | Thermo scientific | #EN0525 | 1000 U |
| Magnesium chloride | Thermo scientific | EN0525 | 1.25 mL |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Thermo scientific | EN0525 | 1 mL |
| dNTP mix | Thermo scientific | R0191 | R0191 |
| SYBR Green qPCR Master Mix (2X) | Thermo scientific | K0251 | For 200 reactions of 25 µL |
| PikoReal | Thermo scientific | 2.2 | Software |
| Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure | USB | J75829 | 100 mL |
| Isopropyl alcohol | Karal | 2040 | 1 L |
| Ethyl alcohol | SIGMA | 64175 | 1 L |
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA | D5758 | 100 mL |
| Lab Rotator | LW Scientific | Mod. LW210 |
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