מיצוי קפאין, פעילות אנזימטיות, ביטוי גנים של קפאין סינתאז מ המתלים תא צמח
Summary
פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה יעיל עבור חילוץ ו כימות של קפאין ב השעיות תא של ערביקה ג ל’ ואת תהליך ניסיוני להערכת הפעילות האנזימטית מתרחשת של קפאין סינתאז עם רמת ביטוי הגן המקודד אנזים זה.
Abstract
קפאין (1,3,7-trimethylxanthine) הוא אלקלואיד פורין נוכח משקאות פופולריים כמו קפה ותה. מטבוליט המשני הזה נחשב הגנה כימית בגלל זה יש פעילות מיקרוביאלית, והוא נחשב של חרקים טבעי. קפאין יכול לייצר גם השפעות שליליות allelopathic למנוע את התפתחותם של צמחים שמסביב. בנוסף, אנשים ברחבי העולם צורכים קפאין על השפעותיו להרגעה, מופחתים. בשל עניין היישומים הטכנולוגיים של קפאין, מחקר על מסלול biosynthetic הוחלף נגזר של מתחם זה גדל. מחקרים אלה התמקדו בעיקר הבנת המנגנונים הביוכימי והמולקולרי המסדירים ביוסינטזה של קפאין. במבחנה תרביות רקמה הפכה מערכת שימושי ללמוד מסלול זה biosynthetic הוחלף נגזר. מאמר זה יתאר פרוטוקול צעד אחר צעד עבור כימות של קפאין, מדידת הרמות את התעתיק של הגן (CCS1) אשר קידוד קפאין סינתאז (CS) ב השעיות תא של ערביקה ג ל, כמו גם את פעילותה.
Introduction
קפאין הוא מטבוליט משני זה biosynthesized על-ידי צמחים הסוג קפה1. אלקלואיד הזה שייך למשפחת methylxanthine, נחשב כהגנה מפעל כימי כי הוא יכול להתנהג מול ההשפעות השליליות של גורמי מחלה, אוכלי עשב2,3. בנוסף, מטבוליט זו אחראית על מאפייני מגרה לשתות קפה, אשר הוא נצרך בדרך כלל עולמית4,5. בשל תכונותיו, מספר קבוצות מחקר מעוניינות ללמוד את מסלול biosynthetic הוחלף נגזר ולבצע קטבוליזם של קפאין6,7. כיום, המפעל במבחנה תרבויות תא/רקמות לשמש אלטרנטיבה להערכת קפאין הצטברות תחת אסטרטגיות והאביוטיים ביוטיים שונים8,9.
קפאין ביוסינטזה מערבת את שחרור hydrolytic של 7-methylxanthine nucleoside ריבוז המתאים ואחריו מסודרות N-methylations-עמדות 3 ו- 1. ספציפית S– adenosyl מתיונין (SAM)-N התלויים-(nmt ב) methyltransferase מזרז מתילציה במיקום 7, ואילו תאוברומין סינתאז (TS) במדעי המחשב הם מעורבים ב 3 – ו 1-methylations, בהתאמה, בהפקת תאוברומין ו קפאין. המחקר של גנים קידוד NMTs ברורים אפשרה להבנת המנגנון המווסת קפאין ייצור10,11. הפקולטה למדעי המחשב, אשר יש N –פעילות methyltransferase, מזרז את שני השלבים האחרונים של הנתיב biosynthetic הוחלף נגזר של קפאין11. בשתילי עץ הקפה, הוכח כי קרינה אור יכול להגביר פעילות בפקולטה למדעי המחשב, כשהתוצאה היא עלייה ביוסינטזה קפאין. לאחרונה, הראינו כי שמירה על התא השעיות של ערביקה ג ל’ תחת אור הקרנה היא התנאי האופטימלית להערכת ההשפעות המייצרים והאביוטיים גורמים להשפיע על מסלול biosynthetic הוחלף נגזר של קפאין8. המידע הנקלט במחקרים אלה ייתכן יישומים בביולוגיה מערכות והנדסה מטבולית עבור למקסם את המחקר של הנתיב biosynthetic הוחלף נגזר קפאין במערכות כאלה במבחנה .
לאור היתרונות של קבלת מודל מתאים לצורך המחקר של קפאין ביוסינטזה, אנחנו ממוטב תנאי מיצוי קפאין על התא המתלים של ערביקה ג ל’ היה זה גם אפשר לפתח פרוטוקול שימושי ללמוד את פעילות אנזימטי וכן את השלבים מתודולוגי להערכת רמת גן תעתיקים של קפה קפאין סינתאז 1 (CCS1) קידוד אנזים זה. במסמך זה, אנו מדווחים על פרוטוקול כדי לחלץ ולכמת קפאין ב השעיות תא ערביקה ג על ידי שכבת דק ו- densitometry (TLC-densitometry).
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מציגים כאן את תנאים אופטימליים עבור הערכת את הקפאין תוכן, פעילות CS ורמות תעתיק במבחנה לשתול תרביות רקמה, כגון תא השעיות של ערביקה ג. בדו”חות קודמים אישרו כי שמירה על תאים תחת אור הקרנה ובפני תאוברומין במדיום תרבות הם פרמטרים מתאימים להגדיל את רמת של קפאין, כך שניתן להעריך את שי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה של המעבדה שלנו מומן על ידי מענק Consejo נאסיונאל דה Ciencia, y Tecnología (CONACyT 219893) SMTHS. מחקר זה גם נתמך על ידי התחברות שהוענקו RJPK (מס 37938) מאת CONACyT, את “סיסטמה” נסיונאל דה Investigadores (4422). המחברים תודה CIATEJ על השימוש של התקנות שלה במהלך הכתיבה של כתב היד הזה. תודה מיוחדת מורחבות כדי ד ר Víctor מנואל גונזלס מנדוזה לקבלת המלצות כל סעיף ביולוגיה מולקולרית, ולנטין מנדוזה רודריגס, IFC, UNAM מתקנים במהלך הצילומים של מאמר זה.
Materials
| Murashige & Skoog Basal salt mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1) |
| Caffeine | SIGMA | C0750-5G | STANDARD-5g |
| Theobromine | SIGMA | T4500 | 20 g |
| CAMAG TLC Scanner-4 | CAMAG | 27.62 | |
| WinCATS Planar Chromatography Manager software | CAMAG | 1.4.10 | Software |
| Isoamyl alcohol (24:1) | SIGMA | C-0549 | 500 mL |
| Cyclohexane | JALMEX | C4375-13 | 1 L |
| Acetone | J.T. BAKER | 900643 | 4 L |
| Methanol | J.T. BAKER | 9093-03 | 4 L |
| Chloroform | JALMEX | C-4425-15 | 3.5 L |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | 1.05554.0001 | TLC plate |
| β-mercaptoethanol | M6250 | SIGMA | 100 mL |
| (+)-sodium L- ascorbate | A4034 | SIGMA | 100 g |
| Trizma base | SIGMA | T6066 | 1 Kg |
| Hydrochloric acid 36.5-38% | J.T. Baker | 9535-05 | 2.5 L |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 232227 | Kit |
| Methyl [3H]-S-adenosyl methionine | Perkin Elmer | NET155 | Specific activity of 15 Ci/mmol |
| Liquid scintillation vials | SIGMA | Z253081 | |
| Thermostatic bath/circulator | Cole Parmer | 60714 | |
| Micro centrifugue tube | Eppendorf | Tube of 1.5 mL | |
| Cryogenic vials | Heathrow Scientific | HS23202A | 2 mL |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf | 5804 000925 | |
| Vortex | Thermolyne | LR 5947 | |
| Porcelain mortar | Fisherbrand | FB961B | |
| Filter paper | Whatman | Z274844 | Porosity medium |
| Picofuge | Stratagene | 400550 | 2000 x g |
| Analytical balance | AND | HR-120 | Model HR-120 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | 6500 | |
| Gel photodocumentation system | Bio-Rad | Chemic XRS | Model Chemic XRS |
| Compact UV lamp | UVP | 95002112 | UVGL-25 |
| Scienceware HDPE Buchner funnel | SIGMA | 2419907 | Type 37600 mixer |
| TRIzol reagent | Thermo scientific | 15596-018 | 200 mL |
| ReverdAid Reverse transcriptase | Thermo scientific | #EP0441 | 10000 U |
| Oligo (dT)18 primer | Thermo scientific | #S0131 | 100 µM |
| DNase I, RNase-free | Thermo scientific | #EN0525 | 1000 U |
| Magnesium chloride | Thermo scientific | EN0525 | 1.25 mL |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Thermo scientific | EN0525 | 1 mL |
| dNTP mix | Thermo scientific | R0191 | R0191 |
| SYBR Green qPCR Master Mix (2X) | Thermo scientific | K0251 | For 200 reactions of 25 µL |
| PikoReal | Thermo scientific | 2.2 | Software |
| Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure | USB | J75829 | 100 mL |
| Isopropyl alcohol | Karal | 2040 | 1 L |
| Ethyl alcohol | SIGMA | 64175 | 1 L |
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA | D5758 | 100 mL |
| Lab Rotator | LW Scientific | Mod. LW210 |
References
- Ferruzzi, M. G. The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea. Physiolgy & Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).
- Majhenič, L., Škerget, M., Knez, &. #. 3. 8. 1. ;. Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts. Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).
- Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria. Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).
- Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. Caffeine in the management of patients with headache. Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).
- De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. Impact of caffeine and coffee on our health. Trends in Endocrinology & Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).
- Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant. Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).
- Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis. Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).
- Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture. Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).
- Pech-Kú, R., Muñoz-Sánchez, J. A., Monforte-González, M., Vázquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., González-Mendoza, V. M., Hernández-Sotomayor, S. T. Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L. Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).
- Huang, R., O’Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).
- Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.). FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).
- Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves. Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Method. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells. Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).
- Sartor, R. M., Mazzafera, P. Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei. Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).
- Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits. Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).
- Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gonçalves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit. Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).
- Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta). Planta. 241 (1), 179-191 (2015).
