Extraction de la caféine, l’activité enzymatique et l’Expression génique de caféine Synthase de Suspensions de cellules végétales
Summary
Ce protocole décrit une méthodologie efficace pour l’extraction et le dosage de la caféine dans des suspensions cellulaires de c. arabica L. et un processus d’expérimentation pour l’évaluation de l’activité enzymatique de synthase de caféine avec le niveau d’expression de le gène codant pour cette enzyme.
Abstract
Caféine (1,3,7-trimethylxanthine) est un alcaloïde de la purine présent dans les boissons populaires tels que le café et le thé. Ce métabolite secondaire est considéré comme un moyen de défense chimique, car il a une activité antimicrobienne et est considéré comme un insecticide naturel. Caféine peut également produire des effets allélopathiques négatifs qui empêchent la croissance des plantes environnantes. En outre, les gens partout dans le monde consomment caféine pour ses effets analgésiques et stimulants. En raison de l’intérêt pour les applications technologiques de la caféine, recherches sur la voie de biosynthèse de ce composé a augmenté. Ces études ont principalement porté sur la compréhension des mécanismes biochimiques et moléculaires qui régulent la biosynthèse de la caféine. Culture de tissus in vitro est devenu un système utile pour l’étude de cette voie de biosynthèse. Cet article décrit un protocole étape par étape pour la quantification de la caféine et de mesure des niveaux de transcription du gène (CCS1) codant synthase (CS) de la caféine dans des suspensions de cellules de c. arabica L. en plus de son activité.
Introduction
La caféine est un métabolite secondaire qui est biosynthétisée à partir de plantes du genre Coffea1. Cet alcaloïde appartient à la famille des méthylxanthines et est considéré comme une défense de l’usine de produits chimiques car il peut agir contre les effets néfastes des pathogènes et des herbivores,2,3. En outre, ce métabolite est responsable des propriétés stimulantes de la boisson de café, qui est couramment consommée dans le monde entier4,,5. En raison de ses propriétés, sont intéressés par plusieurs groupes de recherche étudie la voie de biosynthèse et de catabolisme de caféine6,7. Actuellement, des cultures de plantes in vitro cellules/tissus servent d’alternative pour évaluer l’accumulation de la caféine sous diverses stratégies biotiques et abiotiques8,9.
Biosynthèse de caféine implique la libération hydrolytique des 7-méthylxanthine de nucléoside ribose correspondante suivie d’ordonnée N-méthylations aux positions 3 et 1. Une spécifique S– adénosyl méthionine (SAM)-charge N-méthyltransférase (NMT) catalyse la méthylation en position 7, tandis que théobromine synthase (TS) et CS sont impliqués dans la 3 – et 1-méthylations, respectivement, produisant la théobromine et caféine. L’étude des gènes codant pour les territoires non métropolitains distincts a permis de comprendre le mécanisme qui régule la production de caféine10,11. CS, qui possède l’activité N –méthyltransférase, catalyse les deux dernières étapes de la biosynthèse de la caféine,11. Chez les plantules de caféier, il a été démontré que le rayonnement lumineux peut augmenter l’activité CS, qui se traduit par une augmentation dans la biosynthèse de la caféine. Récemment, nous avons montré que l’entretien des suspensions cellulaires de c. arabica L. sous irradiation lumineuse est la condition optimale pour évaluer les effets que produisent des facteurs de stress abiotique ayant une incidence sur la voie de biosynthèse de caféine8. Les renseignements obtenus dans ces études pourraient avoir des applications en biologie de systèmes et génie métabolique pour maximiser l’étude de la biosynthèse de la caféine dans de tels systèmes in vitro .
Étant donné les avantages d’obtenir un modèle approprié pour l’étude de la biosynthèse de la caféine, nous avons optimisé les conditions d’extraction de la caféine sur des suspensions cellulaires c. arabica L. Il était également possible d’élaborer un protocole utile pour l’étude de l’activité enzymatique, mais aussi les étapes méthodologiques permettant d’évaluer le niveau de transcription des gènes de Coffea caféine synthase 1 (CCS1) codant pour cette enzyme. Ici, nous présentons un protocole pour extraire et quantifier la caféine dans les suspensions de cellules de c. arabica par chromatographie sur couche mince et densitométrie (TLC-densitométrie).
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous présentons ici les conditions optimales permettant d’évaluer la contenu de caféine, niveaux d’activité et de transcription CS dans in vitro plant tissue culture, tels que des suspensions de cellules de c. arabica. Précédents rapports ont confirmé que les cellules maintien sous irradiation lumineuse et en présence de théobromine dans le milieu de culture sont les paramètres appropriés pour augmenter le niveau de caféine, ce qui permet d’évaluer les méthodes de séparation de caf?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les travaux de notre laboratoire a été financée par une subvention par le Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) à SMTHS. Aussi, cette recherche a été financée par une bourse de recherche accordée à RJPK (no 37938) par CONACyT et le Sistema Nacional de Investigadores (4422). Les auteurs remercient CIATEJ pour l’utilisation de ses installations pendant l’écriture de ce manuscrit. Spécial remerciements à m. Víctor Manuel González Mendoza pour toutes les recommandations dans la section de biologie moléculaire et Rodríguez Mendoza Valentín, IFC, UNAM pour les installations pendant le tournage de cet article.
Materials
| Murashige & Skoog Basal salt mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1) |
| Caffeine | SIGMA | C0750-5G | STANDARD-5g |
| Theobromine | SIGMA | T4500 | 20 g |
| CAMAG TLC Scanner-4 | CAMAG | 27.62 | |
| WinCATS Planar Chromatography Manager software | CAMAG | 1.4.10 | Software |
| Isoamyl alcohol (24:1) | SIGMA | C-0549 | 500 mL |
| Cyclohexane | JALMEX | C4375-13 | 1 L |
| Acetone | J.T. BAKER | 900643 | 4 L |
| Methanol | J.T. BAKER | 9093-03 | 4 L |
| Chloroform | JALMEX | C-4425-15 | 3.5 L |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | 1.05554.0001 | TLC plate |
| β-mercaptoethanol | M6250 | SIGMA | 100 mL |
| (+)-sodium L- ascorbate | A4034 | SIGMA | 100 g |
| Trizma base | SIGMA | T6066 | 1 Kg |
| Hydrochloric acid 36.5-38% | J.T. Baker | 9535-05 | 2.5 L |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 232227 | Kit |
| Methyl [3H]-S-adenosyl methionine | Perkin Elmer | NET155 | Specific activity of 15 Ci/mmol |
| Liquid scintillation vials | SIGMA | Z253081 | |
| Thermostatic bath/circulator | Cole Parmer | 60714 | |
| Micro centrifugue tube | Eppendorf | Tube of 1.5 mL | |
| Cryogenic vials | Heathrow Scientific | HS23202A | 2 mL |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf | 5804 000925 | |
| Vortex | Thermolyne | LR 5947 | |
| Porcelain mortar | Fisherbrand | FB961B | |
| Filter paper | Whatman | Z274844 | Porosity medium |
| Picofuge | Stratagene | 400550 | 2000 x g |
| Analytical balance | AND | HR-120 | Model HR-120 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | 6500 | |
| Gel photodocumentation system | Bio-Rad | Chemic XRS | Model Chemic XRS |
| Compact UV lamp | UVP | 95002112 | UVGL-25 |
| Scienceware HDPE Buchner funnel | SIGMA | 2419907 | Type 37600 mixer |
| TRIzol reagent | Thermo scientific | 15596-018 | 200 mL |
| ReverdAid Reverse transcriptase | Thermo scientific | #EP0441 | 10000 U |
| Oligo (dT)18 primer | Thermo scientific | #S0131 | 100 µM |
| DNase I, RNase-free | Thermo scientific | #EN0525 | 1000 U |
| Magnesium chloride | Thermo scientific | EN0525 | 1.25 mL |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Thermo scientific | EN0525 | 1 mL |
| dNTP mix | Thermo scientific | R0191 | R0191 |
| SYBR Green qPCR Master Mix (2X) | Thermo scientific | K0251 | For 200 reactions of 25 µL |
| PikoReal | Thermo scientific | 2.2 | Software |
| Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure | USB | J75829 | 100 mL |
| Isopropyl alcohol | Karal | 2040 | 1 L |
| Ethyl alcohol | SIGMA | 64175 | 1 L |
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA | D5758 | 100 mL |
| Lab Rotator | LW Scientific | Mod. LW210 |
References
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