Derivación y diferenciación de células mesenquimales ovárico canino
Summary
Adjunto, describimos un método para el aislamiento, expansión y diferenciación de células madre mesenquimales de tejido ovárico canino.
Abstract
Interés en las células madre mesenquimales (MSCs) ha aumentado en la última década debido a su facilidad de aislamiento, expansión y cultura. Recientemente, estudios han demostrado la capacidad de diferenciación amplia que poseen estas células. El ovario representa a un candidato prometedor para las terapias basadas en células debido a que es rica en MSCs y con frecuencia se descarta después de cirugías de ovariectomía como residuos biológicos. Este artículo describe los procedimientos para el aislamiento, expansión, y la diferenciación de MSCs derivado de ovario canino, sin la necesidad de clasificación celular técnicas. Este protocolo representa una herramienta importante para la medicina regenerativa debido a la amplia aplicabilidad de estas células altamente diferenciables en ensayos clínicos y aplicaciones terapéuticas.
Introduction
El número de estudios publicados que enfoque en células madre ha aumentado sustancialmente en la última década, un esfuerzo de investigación que ha sido impulsado por el colectivo objetivo de descubrir terapias de Medicina Regenerativa de gran alcance. Las células madre tienen dos marcadores definición primarios: auto renovación y diferenciación. Las células madre mesenquimales son responsables de la facturación de tejido regular y tienen una capacidad más limitada de la diferenciación en comparación con las células madre embrionarias1. Recientemente, muchos estudios han demostrado una amplia gama de la diferenciación de MSCs y un tema en discusión es si existen diferencias entre las células madre embrionarias y adultas en todos los2.
El epitelio superficial de ovarium es una sin compromiso capa de células, relativamente menos diferenciada, que expresa ambos marcadores epiteliales y mesenquimales3, conservando la capacidad de diferenciarse en diferentes tipos de células en respuesta a señales ambientales4. La ubicación exacta de las células madre en el ovario no es conocida; sin embargo, se ha propuesto que bipotential progenitores en la túnica albugínea dan lugar a las células germinales5. Estudios inmunológicos han presumido que estas células tienen un origen estromal6 o se encuentra en o próximo a la superficie del ovario7. Puesto que las células madre mesenquimales expresa numerosos receptores que desempeñan un papel importante en la adherencia de la célula8, fue diseñado un experimento para probar la hipótesis de que la selección de una población de células con una rápida adhesión aislaría a una población de células claramente caracterizables como mesenquimales en la naturaleza. Recientemente, nuestro grupo reportó la derivación de MSCs del tejido ovárico basado en su capacidad de adherencia a la superficie de plástico de la placa de cultivo en las primeras 3 h de la cultura, con el fin de obtener una población purificada de células exhibe adherencia rápida9. Aquí, describimos el método desarrollado para el aislamiento de células madre mesenquimales del tejido ovárico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí proporcionamos evidencia que MSCs pueden ser aislados del tejido ovárico canino, que se considera residuos biológicos después de la ovariectomía. Debido a que muchos tipos de células pueden encontrarse en el ovario, propusimos un protocolo para seleccionar MSCs en su rápida adhesión al plástico, que selecciona con éxito células que crecieron en una monocapa con una morfología de fibroblasto-como base.
El primer informe de la derivación de MSCs de médula ósea se basa en la c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen el programa de esterilización canina en la UNESP-FCAV por proporcionar amablemente los ovarios. Este trabajo fue financiado por becas del FAPESP (proceso nº 2013/14293-0) y capas.
Materials
| DPBS | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Collagenase I | Thermo Fisher | 17100017 | |
| Tissue flask | Corning | CLS3056 | |
| DMEM low glucose | Thermo Fisher | 11054020 | |
| FBS | Thermo Fisher | 12484-010 | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604021 | |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007001 | |
| StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007101 | |
| StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007201 | |
| STEMdiff Definitive Endoderm Kit | StemCell | 5110 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15070063 | |
| CD45 | AbD Serotec | MCA 2035S | |
| CD34 | AbD Serotec | MCA 2411GA | |
| CD90 | AbD Serotec | MCA 1036G | |
| CD44 | AbD Serotec | MCA 1041 | |
| Nestin | Milipore | MAB353 | |
| β-Tubulin | Milipore | MAB1637 | |
| DDX4 | Invitrogen | PA5 -23378 | |
| IgG- FITC | AbD Serotec | STAR80F | |
| IgG- FITC | AbD Serotec | STAR120F |
References
- Gazit, Z., Pelled, G., Sheyn, D., Kimelman, N., Gazit, D., Atala, A., Lanza, R. Mesenchymal stem cells. Handbook of Stem Cells (2nd Edition). , 513-527 (2013).
- Zipori, D. The nature of stem cells: state rather than entity. Nature Reviews Genetics. 5 (11), 873-878 (2004).
- Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocrine Reviews. 22 (2), 255-288 (2001).
- Ahmed, N., Thompson, E. W., Quinn, M. A. Epithelial-mesenchymal interconversions in normal ovarian surface epithelium and ovarian carcinomas: an exception to the norm. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 581-588 (2007).
- Bukovsky, A., Svetlikova, M., Caudle, M. R. Oogenesis in cultures derived from adult human ovaries. Reproductive Biology and Endocrinology. 3 (1), 17 (2005).
- Gong, S. P., et al. Embryonic stem cell-like cells established by culture of adult ovarian cells in mice. Fertility and Sterility. 93 (8), 2594-2601 (2010).
- Johnson, J., Canning, J., Kaneko, T., Pru, J. K., Tilly, J. L. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature. 428 (6979), 145 (2004).
- Deans, R. J., Moseley, A. B. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Experimental Hematology. 28 (8), 875-884 (2000).
- Trinda Hill, A. B. T., Therrien, J., Garcia, J. M., Smith, L. C. Mesenchymal-like stem cells in canine ovary show high differentiation potential. Cell Proliferation. 50 (6), 12391 (2017).
- Dominici, M. L. B. K., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 4315-4317 (2006).
- Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. Development. 16 (3), 381-390 (1966).
- Kuznetsov, S. A., et al. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (9), 1335-1347 (1997).
