Summary

גזירת ובידול של הכלבים השחלות בתאי גזע Mesenchymal

Published: December 16, 2018
doi:

Summary

במסמך זה, אנו מתארים שיטה עבור בידוד, הרחבה, הבידול של גזע mesenchymal מרקמות השחלה הכלביים.

Abstract

עניין גזע mesenchymal (MSCs) גדל בעשור האחרון בשל הקלות שלהם של בידוד, הרחבת והתרבות. לאחרונה, מחקרים הוכיחו יכולת התמיינות רחב שקיימים תאים אלה. השחלה מייצג מועמד מבטיח טיפולים מבוססי תאים בשל העובדה כי הוא עשיר ב MSCs וכי לעתים קרובות נמחקים לאחר ניתוחים ovariectomy כפסולת ביולוגית. מאמר זה מתאר נהלי הבידוד, הרחבה, ואת הבידול של MSCs נגזר מן השחלה הכלביים, ללא הצורך של מיון תא טכניקות. פרוטוקול זה מייצג כלי חשוב עבור רפואה רגנרטיבית בשל תחולתה רחבה של תאים אלה מאוד דיפרנציאבילית בניסויים קליניים, משתמש טיפולית.

Introduction

מספר מחקרים שפורסמו להתמקד בתאי גזע גדל באופן משמעותי בעשר השנים האחרונות, מאמץ המחקר כי הושגה על ידי המטרה הקולקטיבית של גילוי טיפולי רפואה רגנרטיבית עוצמה. תאי גזע יש שני סמנים המעצב הראשי: העצמי – שיפוץ ובידול. גזע mesenchymal אחראי על תחלופת רקמת רגיל, יש קיבולת מוגבלת יותר של בידול בהשוואה בתאי גזע עובריים1. לאחרונה, מחקרים רבים הראו מגוון רחב של הבידול של MSCs, נושא בדיון אם קיימים הבדלים בין תאי גזע עובריים והוא בוגר כל2.

Ovarium פני האפיתל היא uncommitted שכבה של תאים, יחסית פחות הבדיל, אשר מבטאת שני סמנים אפיתל, mesenchymal3, שמירה על היכולת להבדיל בין סוגים שונים של תאים בתגובה אותות סביבתיים4. המיקום המדויק של תאי גזע בשחלה אינה ידועה; עם זאת, שהוא הוצע כי אבות bipotential, albuginea tunica להצמיח בתאי הנבט5. מחקרים אימונולוגי יש שיערו כי תאים אלה יש מקור סטרומה6 או ממוקם או מקורב ביותר השחלה משטח7. מאז בתאי גזע mesenchymal אקספרס קולטנים רבים יש תפקיד חשוב ב תא אדהזיה8, תוכנן ניסוי כדי לבדוק את ההשערה כי בחירת אוכלוסיה של תאים עם הדבקה מהירה לבודד אוכלוסיה של תאים בבירור characterizable כמו mesenchymal בטבע. לאחרונה, הקבוצה שלנו דיווחו על ההטיה של MSCs מרקמות השחלה בהתבסס על הקיבולת של הדבקה על משטח הפלסטיק של המנה תרבות ב ה 3 הראשון של תרבות, על מנת לקבל אוכלוסייה מטוהרים של תאים מפגין הדבקה מהירה9. כאן נתאר שיטת שפותחו עבור בידוד תאי גזע mesenchymal של רקמת השחלה.

Protocol

הניסוי בוצע עם השחלות של ארבעה כלבי תערובת הנשי, שנתרמו לאחר ניתוח אלקטיבי-תוכנית עיקור כלבים. ניסוי זה אושרה על ידי ועדת האתיקה על השימוש בבעלי חיים של UNESP-FCAV (פרוטוקול מס 026991/13). 1. הכנה ניסיוני להכין או לרכוש 500 מ”ל תמיסת סטרילית של Dulbecco באגירה פוספט (DPBS) ללא סידן או מגנזי…

Representative Results

בידוד תאי גזע mesenchymal מן השחלה הכלבים: ההליך בידוד MSC השחלות מסוכם באיור1. לאחר הניתוח, רקמות הא, collagenase עיכול, שינוי מדיה 3 שעות לאחר תחילת התרבות, אוכלוסיה MSC בשם עם מאפיינים פלסטיק-דבק מהיר הופרדה בהצלחה מר…

Discussion

בזאת אנו מספקים ראיות כי MSCs ניתן לבודד מרקמות השחלה הכלביים, אשר נחשב פסולת ביולוגית לאחר ovariectomy. בשל העובדה כי ניתן למצוא סוגי תאים רבים בשחלה, הצענו פרוטוקול לבחירת MSCs בהתבסס על שדבקו מהירה פלסטיק, אשר בהצלחה נבחרים תאים שגדל טפט עם מורפולוגיה פיברובלסט דמוי.

הדוח הראשון ש?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים להכיר התוכנית עיקור כלבים UNESP-FCAV מתבקשים לספק את השחלות. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים FAPESP (תהליך מס 2013/14293-0), שכמיות.

Materials

DPBS  Thermo Fisher 14190144
Collagenase I Thermo Fisher 17100017
Tissue flask Corning CLS3056
DMEM low glucose Thermo Fisher 11054020
FBS Thermo Fisher 12484-010
TrypLE express Thermo Fisher 12604021
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007201
STEMdiff Definitive Endoderm Kit StemCell 5110
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15070063
CD45 AbD Serotec MCA 2035S
CD34 AbD Serotec MCA 2411GA
CD90 AbD Serotec MCA 1036G
CD44 AbD Serotec MCA 1041
Nestin Milipore MAB353
β-Tubulin  Milipore MAB1637
DDX4 Invitrogen PA5 -23378
IgG- FITC AbD Serotec STAR80F
IgG- FITC AbD Serotec STAR120F

References

  1. Gazit, Z., Pelled, G., Sheyn, D., Kimelman, N., Gazit, D., Atala, A., Lanza, R. Mesenchymal stem cells. Handbook of Stem Cells (2nd Edition). , 513-527 (2013).
  2. Zipori, D. The nature of stem cells: state rather than entity. Nature Reviews Genetics. 5 (11), 873-878 (2004).
  3. Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocrine Reviews. 22 (2), 255-288 (2001).
  4. Ahmed, N., Thompson, E. W., Quinn, M. A. Epithelial-mesenchymal interconversions in normal ovarian surface epithelium and ovarian carcinomas: an exception to the norm. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 581-588 (2007).
  5. Bukovsky, A., Svetlikova, M., Caudle, M. R. Oogenesis in cultures derived from adult human ovaries. Reproductive Biology and Endocrinology. 3 (1), 17 (2005).
  6. Gong, S. P., et al. Embryonic stem cell-like cells established by culture of adult ovarian cells in mice. Fertility and Sterility. 93 (8), 2594-2601 (2010).
  7. Johnson, J., Canning, J., Kaneko, T., Pru, J. K., Tilly, J. L. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature. 428 (6979), 145 (2004).
  8. Deans, R. J., Moseley, A. B. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Experimental Hematology. 28 (8), 875-884 (2000).
  9. Trinda Hill, A. B. T., Therrien, J., Garcia, J. M., Smith, L. C. Mesenchymal-like stem cells in canine ovary show high differentiation potential. Cell Proliferation. 50 (6), 12391 (2017).
  10. Dominici, M. L. B. K., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 4315-4317 (2006).
  11. Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. Development. 16 (3), 381-390 (1966).
  12. Kuznetsov, S. A., et al. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (9), 1335-1347 (1997).

Play Video

Cite This Article
Hill, A. B., Hill, J. E., Bressan, F. F., Miglino, M. A., Garcia, J. M. Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (142), e58163, doi:10.3791/58163 (2018).

View Video