Dérivation et différenciation des canines ovarienne des cellules souches mésenchymateuses
Summary
Ici, on décrit une méthode pour l’isolation, l’expansion et la différenciation des cellules souches mésenchymateuses du tissu ovarien canin.
Abstract
Intérêt pour les cellules souches mésenchymateuses (CSM) a augmenté ces dix dernières années en raison de leur facilité d’isolement, l’expansion et la culture. Récemment, des études ont démontré la capacité de différenciation large que ces cellules possèdent. L’ovaire représente un candidat prometteur pour les thérapies à base de cellules due au fait que c’est riche en MSCs et qu’elle est fréquemment ignorée après chirurgies ovariectomie comme un déchet biologique. Cet article décrit les procédures pour l’isolement, l’expansion, et différenciation des MSCs dérivée de l’ovaire canine, sans la nécessité du tri des cellules techniques. Ce protocole représente un outil important pour la médecine régénérative en raison de la large applicabilité de ces cellules fortement différentiables dans les essais cliniques et applications thérapeutiques.
Introduction
Le nombre d’études publiées qui mettant l’accent sur les cellules souches a considérablement augmenté ces dix dernières années, un effort de recherche qui a été alimenté par l’objectif commun de découverte des thérapies de médecine régénérative puissant. Les cellules souches ont deux marqueurs définissant primaires : auto – rénovation et la différenciation. Cellules souches mésenchymateuses sont responsables de chiffre d’affaires de tissu ordinaire et ont une capacité plus restreinte de la différenciation par rapport aux cellules souches embryonnaires1. Récemment, plusieurs études ont montré une large gamme de différenciation de MSCs, et un sujet en discussion est de savoir si il existe des différences entre les cellules souches embryonnaires et adultes à tous les2.
L’épithélium de surface ovarium est une couche non validée de cellules, relativement moins différenciée, qui exprime les deux marqueurs épithéliaux et mésenchymateux3, conservant la capacité de se différencier en différents types de cellules en réponse à signaux environnementaux4. L’emplacement exact des cellules souches dans l’ovaire n’est pas connue ; Toutefois, il a été proposé que bipotential progéniteurs dans l’albuginée donnent naissance à des cellules germinales5. Les études immunologiques ont émis l’hypothèse que ces cellules ont une origine stromales6 ou sont situés dans ou proximale à la surface de l’ovaire7. Étant donné que les cellules souches mésenchymateuses exprimant des récepteurs nombreuses qui jouent un rôle important dans la cellule adhérence8, une expérience a été conçue pour tester l’hypothèse selon laquelle la sélection d’une population de cellules avec adhérence rapide isolerait clairement une population de cellules caractérisable comme mésenchymateuses dans la nature. Récemment, notre groupe a signalé la dérivation de MSCs de tissu ovarien basée sur leur capacité d’adhérence à la surface en plastique de la boîte de Petri pendant les 3 premières heures de la culture, afin d’obtenir une population purifiée de cellules présentant une adhérence rapide9. Nous décrivons ici la méthode développée pour l’isolement de cellules souches mésenchymateuses du tissu ovarien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci-après nous fournir la preuve que MSCs peuvent être isolés du tissu ovarien canin, qui est considéré comme un déchet biologique après une ovariectomie. Dû au fait que plusieurs types de cellules se trouvent dans l’ovaire, nous avons proposé un protocole pour sélectionner MSCs basés sur leur adhésion rapide au plastique, qui a sélectionné les cellules qui s’est développée en une monocouche avec une morphologie des fibroblastes.
Le premier rapport de la dérivation de MSCs …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le programme de stérilisation canine à UNESP-FCAV pour aimablement les ovaires. Ce travail a été soutenu par des subventions de la FAPESP (processus no 2013/14293-0) et CAPES.
Materials
| DPBS | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Collagenase I | Thermo Fisher | 17100017 | |
| Tissue flask | Corning | CLS3056 | |
| DMEM low glucose | Thermo Fisher | 11054020 | |
| FBS | Thermo Fisher | 12484-010 | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604021 | |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007001 | |
| StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007101 | |
| StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007201 | |
| STEMdiff Definitive Endoderm Kit | StemCell | 5110 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15070063 | |
| CD45 | AbD Serotec | MCA 2035S | |
| CD34 | AbD Serotec | MCA 2411GA | |
| CD90 | AbD Serotec | MCA 1036G | |
| CD44 | AbD Serotec | MCA 1041 | |
| Nestin | Milipore | MAB353 | |
| β-Tubulin | Milipore | MAB1637 | |
| DDX4 | Invitrogen | PA5 -23378 | |
| IgG- FITC | AbD Serotec | STAR80F | |
| IgG- FITC | AbD Serotec | STAR120F |
References
- Gazit, Z., Pelled, G., Sheyn, D., Kimelman, N., Gazit, D., Atala, A., Lanza, R. Mesenchymal stem cells. Handbook of Stem Cells (2nd Edition). , 513-527 (2013).
- Zipori, D. The nature of stem cells: state rather than entity. Nature Reviews Genetics. 5 (11), 873-878 (2004).
- Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocrine Reviews. 22 (2), 255-288 (2001).
- Ahmed, N., Thompson, E. W., Quinn, M. A. Epithelial-mesenchymal interconversions in normal ovarian surface epithelium and ovarian carcinomas: an exception to the norm. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 581-588 (2007).
- Bukovsky, A., Svetlikova, M., Caudle, M. R. Oogenesis in cultures derived from adult human ovaries. Reproductive Biology and Endocrinology. 3 (1), 17 (2005).
- Gong, S. P., et al. Embryonic stem cell-like cells established by culture of adult ovarian cells in mice. Fertility and Sterility. 93 (8), 2594-2601 (2010).
- Johnson, J., Canning, J., Kaneko, T., Pru, J. K., Tilly, J. L. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature. 428 (6979), 145 (2004).
- Deans, R. J., Moseley, A. B. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Experimental Hematology. 28 (8), 875-884 (2000).
- Trinda Hill, A. B. T., Therrien, J., Garcia, J. M., Smith, L. C. Mesenchymal-like stem cells in canine ovary show high differentiation potential. Cell Proliferation. 50 (6), 12391 (2017).
- Dominici, M. L. B. K., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 4315-4317 (2006).
- Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. Development. 16 (3), 381-390 (1966).
- Kuznetsov, S. A., et al. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (9), 1335-1347 (1997).
