Подготовка культуры главной ячейки высокого качества из рыбы Pituitaries
Summary
Здесь мы описываем протокол готовить и поддерживать первичный гипофиза клеточных культур от оризии (Oryzias latipes). Оптимизированные условия в этом протоколе учитывать важные параметры, такие как осмотического давления, температуры и рН, подражая физиологических условиях рыба, тем самым позволяя физиологически более значимых результатов.
Abstract
Культура клетки первичной является мощным инструментом обычно используется учеными для изучения клеточных свойства и механизмы изолированных клеток в контролируемой среде. Несмотря на огромные различия в физиологии млекопитающих и рыб протоколы культуры клетки первичной из рыбы часто основаны на условиях млекопитающих культуры, часто с незначительными изменениями. Экологические различия затрагивают не только температуру тела, но и сыворотке крови параметров, таких как осмотического давления, pH и буферной емкости рН. Как клетки культуры средств массовой информации и аналогичные рабочие решения призваны имитировать характеристики внеклеточной жидкости и/или сыворотки крови, к которой адаптируется ячейки, важно, что эти параметры настроены специально для животных в вопросе.
Текущий протокол описывает оптимизирован основной культуры условия для оризии (Oryzias latipes). Протокол предоставляет подробные шаги на как изолировать и поддержания здоровой отделить гипофиза клетки для более чем одной недели и включает в себя следующие шаги: 1. Регулировка осмотического давления до значения найдены в плазме крови оризии, 2. Корректировка Температура инкубации до температуры нормальной оризии (здесь в объекте аквариума) и 3. корректировка pH и бикарбонат буфера значения сопоставима с других рыб, обитающих на аналогичных температурах. Результаты представлены с использованием описанных протокола содействовать физиологически значимые результаты для оризии и может использоваться в качестве справочного руководства учеными, делая культуры главной ячейки от других не млекопитающих видов.
Introduction
Культура клеток является одним из основных инструментов, используемых в молекулярных биологических исследований, обеспечивая отличную модель системы для ответа на различные биологические вопросы, начиная от нормальной клеточной физиологии наркотиков скрининг и канцерогенеза1. Главные ячейки, изолированные непосредственно из тканей животных с помощью ферментных и/или механические методы, часто считаются биологически более актуальным, чем клеточных линий, как биологической реакции может быть ближе к ситуации в естественных условиях . Протоколы для подготовки начального клеточных культур должны быть оптимизированы для каждого вида и ячейки типа интереса для того, чтобы имитировать характеристики, к которым приспособлен ячейки и получить физиологически ощутимые результаты.
Многочисленные протоколы описания условий культуры mammalian клетки систем, в то время как аналогичные протоколы описания основной культуры условий для рыбы клетки довольно скудные в сравнении. Клетки являются уязвимыми к быстрым изменениям температуры, рН и осмотического давления и особенно уязвимы во время процедуры диссоциации. Коммерческие солевых растворов и культуральных сред, используемых для культур клеток млекопитающих не являются оптимальными для костистых рыб, особенно в том, что касается pH буфера охранной и осмотического давления. Таким образом, важно измерить и настроить решения физиологически соответствующие уровни этих параметров в видов, представляющих интерес.
Основная гипофиза культур были сделаны из нескольких видов костистых рыб, в том числе сазан (Cyprinus Карпио)2,3, трава Карп (Ctenopharyngodon растительноядной)4, Золотая рыбка (auratus караси )5,6радужной форели (Oncorhynchus mykiss), угорь (Ангилья Ангилья)7, тилапии (Oreochromis mossambicus)8, данио рерио (Danio рерио)9, а Треска (за morhua)10. Помимо регулировки температуры инкубации видов интерес, некоторые из этих протоколов инкубировали клетки на млекопитающих как условия, которые могут быть оптимальным для видов, представляющих интерес, с рН от 7,2 до 7,5 в атмосфере увлажненный содержит 3-5% CO2. Кроме того это не ясно, если осмоляльность растворов, используемых для подготовки некоторых из этих начальных клеточных культур были скорректированы и стабильной между различными решениями.
Текущий протокол основывается на предыдущей работе с первичных культур от атлантической трески10 и включает в себя корректировку температуры инкубации, осмоляльность, рН и рН буферные системы, включая парциальное давление углекислого газа (ЦУП2), чтобы Физиология оризии (O. latipes). Оризии является пресноводных рыб небольшой (3 – 4 см), родом из Восточной Азии. В эти дни, он используется как модель видов во многих научно-исследовательских лабораториях во всем мире, как он сравнительно легко размножаются и высокой устойчивостью к многих общих заболеваний рыб11. Существует несколько преимуществ использования оризии как модель, включая отклонение температуры от 4 – 40 ° C11, время коротких поколения, прозрачный эмбрионов, секс определение Джин12и последовательности генома13, а также многие другие генетические ресурсы.
Основная культура условия в этом протоколе оптимизированы соответствует температура 26 ° C, что medakas хранятся в объекте рыбы. Кроме того уменьшается от 320 мОсм/кг от атлантической трески, живущих в соленой воде до 290 мОсм/кг для оризии, живущих в пресной воде и в соответствии с нормальной осмотического давления плазмы оризии14осмотического давления. В сравнении типичный осмотического давления плазмы млекопитающих находится в диапазоне 275 – 295 мОсм15. Рыба живет в различных температур и имеют жабры, которые находятся в непосредственном контакте с водой, делая pH и буферной емкости крови и межклеточной жидкости в рыбе, отличаются от тех, в млекопитающих. У млекопитающих культуры средств массовой информации, как правило, включают буферные системы, которые приводят к рН около 7,4, когда средства массовой информации являются достижение равновесного уровня стандартного атмосферу 5% CO2 в увлажненный воздух при температуре 37 ° C. PH-зависит от температуры и значение для нейтральной рН (в воде) увеличивается с снижение температуры16. РН плазмы типичный костистых рыб колеблется от 7,7 до 7.917. Оптимизации этого протокола включают сокращение от рН 7,85 трески, хранится 12 ° c до pH 7,75 для оризии хранится на 26 ° C, увеличивая CO2 от 0,5% до 1%.
Кроме того Емкость буфера бикарбонат довольно сильно отличается в рыб и млекопитающих. CO2 легко осуществляется через жабры рыб и ЦУП2 в воде составляет лишь небольшую часть ЦУП2 в легких18. Изменение температуры или ЦУП2 приведет к изменению pH и буферной среды. Следовательно, pH ни ЦУП2 рекомендуется для инкубации клеток млекопитающих является оптимальным для рыбы клетки, и таким образом, средства массовой информации культуры должны быть оптимизированы с системами буфер, содержащий физиологически соответствующие значения для рыбы и отдельных видов, представляющих интерес. Этот протокол описывает как подготовить культуры главной ячейки от оризии pituitaries и включают корректировки инкубации температуры, осмоляльность, рН и рН буферной системы, помимо других важных параметров, которые необходимо учитывать при подготовке главной ячейки культур от не млекопитающих видов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В vitro клетки культуры системы обеспечивают мощные инструменты для исследователей для ответа множество различных биологических вопросов, если используется в правильном пути1. Важно помнить, что диссоциированных клетки, которые потеряли их соединения в соседние клетк?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект финансировался норвежского университета науки о жизни и исследовательский совет Норвегии, номер гранта 243811 и 244461 (программа аквакультуры). Мы благодарны Лурдес Карреон Тан в Норвежском университете науки о жизни для сохранения объекта рыбы.
Materials
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D8537 | Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol. |
| L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | L5520 | Supplement 500 ml culture medium with 10mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 µm PES sterile filter, before adding 2.5 ml Penicillin-Streptomycin solution (see below for details). |
| NaOH | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5881 | Add drops of 1M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75. |
| NaHCO3 | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | S5761 | 10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 ml culture medium. |
| D-mannitol | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | 63565 | Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm. |
| D-glucose | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | G5400 | 4.5 mM D-glucose equals 405 mg per 500 ml culture medium. |
| GlutaMAX Supplement | Gibco (Life Technologies, Paisley, UK) | 35050-061 | Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100X stock in 500 ml culture medium. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | P0781 | Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 ml of stock solution in 500 ml L-15 medium (equivalent of 50 U/ml Penicillin and 50 µg/ml Streptomycin). |
| Trypsin type II-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T7409 | Prepare 1 mg/ml in dPBS solution. |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | T6522 | Prepare 1 mg/ml in dPBS solution, supplement with 2 µg/ml Dnase I (see details below). |
| Dnase I | Sigma (Merck, Damstadt, Germany) | D5025 | Use in trypsin inhibitor solution (see above). |
| 0.2 µm Polyethersulfone (PES) sterile filter system | Corning Inc. (Corning, NY) | 431097 | Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments. |
| 35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-10-C | Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application. |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11254-20 | Straigt tip |
| Dumont #5/45 fine forceps | Fine Science Tools (CA) | 11253-25 | Angled 45° tip |
| Stereo microscope SZ61 | Olympus Corp. (Tokyo, Japan) | Use for dissection of pituitaries. | |
| Alegra X-22R Centrufuge | Beckman Coulter Inc. (Brea, CA) | With cooling option (similar to current model XR-30). | |
| Water bath | Techne (Staffordshire, UK) | Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do. | |
| Pasteur glass pipettes | VWR (NY) | 612-1701 | Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use. |
| Galaxy MiniStar table centrifuge | VWR (NY) | 521-2844 | Any small table centrigue will do. |
| Fine needles / insect pins | Fine Science Tools (CA) | 26001-40 | Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead. |
| Wax plate | Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish. |
References
- Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , (2010).
- Ribeiro, L. P., Ahne, W. Fish cell culture: initiation of a line of pituitary cells from carp (Cyprinus carpio) to study the release of gonadotropin in vitro. In Vitro. 18 (5), 419-420 (1982).
- Ribeiro, L., Ahne, W., Lichtenberg, V. Primary culture of normal pituitary cells of carp (Cyprinus carpio) for the study of gonadotropin release. In Vitro. 19 (1), 41-45 (1983).
- Wong, A. O., Ng, S., Lee, E. K., Leung, R. C., Ho, W. K. Somatostatin inhibits (d-Arg6, Pro9-NEt) salmon gonadotropin-releasing hormone- and dopamine D1-stimulated growth hormone release from perifused pituitary cells of chinese grass carp, Ctenopharyngodon idellus. General and Comparative Endocrinology. 110 (1), 29-45 (1998).
- Chang, J. P., et al. Use of a pituitary cell dispersion method and primary culture system for the studies of gonadotropin-releasing hormone action in the goldfish, Carassius auratus. I. Initial morphological, static, and cell column perifusion studies. General and Comparative Endocrinology. 77 (2), 256-273 (1990).
- Weil, C., Hansen, P., Hyam, D. Use of pituitary cells in primary culture to study the secretion in rainbow-trout – Setting up and validating the system as assessed by its responsiveness to mammalian and salmon gonadotropin-releasing hormone. General and Comparative Endocrinology. 62 (2), 202-209 (1986).
- Montero, M., LeBelle, N., Vidal, B., Dufour, S. Primary cultures of dispersed pituitary cells from estradiol-pretreated female silver eels (Anguilla anguilla L): Immunocytochemical characterization of gonadotropic cells and stimulation of gonadotropin release. General and Comparative Endocrinology. 104 (1), 103-115 (1996).
- Xu, S. H., Cooke, I. M. Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells. General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).
- Lin, S. W., Ge, W. Differential regulation of gonadotropins (FSH and LH) and growth hormone (GH) by neuroendocrine, endocrine, and paracrine factors in the zebrafish-An in vitro approach. General and Comparative Endocrinology. 160 (2), 183-193 (2009).
- Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO2, and pH. General and Comparative Endocrinology. 178 (2), 206-215 (2012).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka – a model organism from the far East. Nature Reviews Genetics. 3, 53-64 (2002).
- Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
- Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
- Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Letters. 2 (12), (2016).
- Waymouth, C. Osmolality of mammalian blood and of media for culture of mammalian cells. In Vitro. 6 (2), 109-127 (1970).
- Cameron, J. N. Acid-base homeostasis – past and present perspectives. Physiological Zoology. 62 (4), 845-865 (1989).
- Claiborne, J. B., Edwards, S. L., Morrison-Shetlar, A. I. Acid-base regulation in fishes: cellular and molecular mechanisms. Journal of Experimental Zoology. 293 (3), 302-319 (2002).
- Perry, S. F., Tufts, B. L. . Fish respiration. , (1998).
- Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone β-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
- Strandabø, R. A. U., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Molecular and Cellular Endocrinology. 372 (1-2), 128-139 (2013).
- Verbalis, J. G. Brain volume regulation in response to changes in osmolality. Neuroscience. 168 (4), 862-870 (2010).
