Preparazione di una cultura di cellula primaria di alta qualità da cadaveri di pesci

Coltura cellulare è uno dei principali strumenti utilizzati nella ricerca biologica molecolare, fornendo un sistema di modello eccellente per rispondere alle diverse domande biologiche che vanno dal normale fisiologia cellulare a drug screening e carcinogenesi¹. Cellule primarie, isolate direttamente dal tessuto animale utilizzando metodi enzimatici e/o meccanici, sono spesso considerate più biologicamente rilevanti rispetto a linee cellulari come la risposta biologica può essere più vicina alla situazione in vivo . Protocolli per la preparazione di colture cellulari primarie dovrebbero essere ottimizzati per ogni tipo di specie e delle cellule di interesse al fine di imitare le caratteristiche a cui una cella è adattata e ottenere risultati fisiologicamente significativi.

Numerosi protocolli descrivono condizioni di coltura per i sistemi cellulari di mammifero, mentre simili protocolli che descrivono condizioni di coltura primaria per celle di pesce sono piuttosto scarsi in confronto. Le cellule sono vulnerabili a rapidi cambiamenti di temperatura, pH e osmolalità e sono particolarmente fragili durante la procedura di dissociazione. Soluzioni saline commerciali e mezzi di coltura utilizzati per colture cellulari di mammifero non sono ottimali per pesci teleostei, soprattutto in termini di sistemi tampone pH e l’osmolalità. È, pertanto, importante misurare e regolare le soluzioni a livelli fisiologicamente rilevanti di questi parametri nelle specie di interesse.

Colture primarie pituitari sono stati effettuati da diverse specie di pesci teleostei, tra cui la carpa comune (Carpio di Cyprinus)^2,3, erba carpa (idella di Ctenopharyngodon)⁴, ciprino dorato (Carassius auratus di )⁵, trota iridea (Oncorhynchus mykiss)⁶,⁷di anguilla europea (Anguilla anguilla), tilapia (Oreochromis mossambicus)⁸, zebrafish (Danio rerio)⁹, e Merluzzo bianco (Gadus morhua)¹⁰. Oltre alla regolazione della temperatura di incubazione per le specie di interesse, molti di questi protocolli hanno incubato le cellule alle condizioni di mammifero-simili che possono essere non ottimali per le specie di interesse, con un pH da 7.2 a 7.5 in atmosfera umidificata contenenti 3-5% CO₂. Inoltre, è poco chiaro se l’osmolalità delle soluzioni utilizzate per la preparazione di molte di queste colture cellulari primarie sono stati adeguati e stabile tra le diverse soluzioni.

L’attuale protocollo è basato sul precedente lavoro con colture primarie da merluzzo¹⁰ e comprende la regolazione della temperatura di incubazione, osmolalità, pH e sistemi tampone pH, tra cui la pressione parziale di anidride carbonica (pCO₂), a la fisiologia di medaka (o. latipes). Medaka è un pesce d’acqua dolce di piccole dimensioni (3 – 4 cm), originario dell’Asia. In questi giorni, è utilizzato come una specie di modello in molti laboratori di ricerca del mondo, come è relativamente facile da allevare e altamente resistenti a molti comuni pesci malattie¹¹. Ci sono diversi vantaggi di usando medaka come un modello, tra cui una tolleranza di temperatura da 4 – 40 ° C¹¹, un tempo di generazione breve, gli embrioni trasparenti, un sesso-determinazione genica¹²e un genoma sequenziato¹³, come pure molti altri risorse genetiche disponibili.

Le condizioni di coltura primaria in questo protocollo sono ottimizzate per abbinare la temperatura di 26 ° C che medakas sono fornite all’interno della struttura di pesce. Ulteriormente, l’osmolalità è ridotto da 320 mOsm/kg da Atlantic cod vivono in acqua salata a 290 mOsm/kg per medaka vivono in acqua dolce ed è conforme il osmolality normale di medaka plasma¹⁴. In confronto, il tipico osmolality del plasma dei mammiferi è nella gamma di 275-295 mOsm¹⁵. Pesci di vita in una varietà di temperature e hanno branchie che sono a diretto contatto con acqua, rendendo la capacità buffer e pH del sangue e liquido extracellulare nei pesci diversi da quelli nei mammiferi. Terreni di coltura dei mammiferi di solito includono sistemi di polmonatura che provocano un pH di circa 7.4 quando i media sono equilibrati a un atmosfera standard di 5% CO₂ in aria umidificata a 37 ° C. Il pH è dipendente dalla temperatura e il valore di pH neutro (in acqua) aumenta con una diminuzione di temperatura¹⁶. Intervalli di pH tipici pesci teleostei al plasma, da 7,7 a 7,9¹⁷. L’ottimizzazione del presente protocollo hanno compreso una riduzione da pH 7.85 per il merluzzo conservato a 12 ° C a pH 7.75 per medaka mantenuto a 26 ° C aumentando la CO₂ da 0,5% al 1%.

Inoltre, la capacità di tampone del bicarbonato è molto diversa in pesci e mammiferi. CO₂ è facilmente scambiato attraverso le branchie nei pesci e il pCO₂ in acqua è solo una piccola frazione del pCO₂ nel polmone¹⁸. Modifica la temperatura o il pCO₂ cambierà il pH e il tampone del mezzo. Di conseguenza, il pH, né il pCO₂ consigliato per l’incubazione di cellule di mammifero è ottimale per le cellule di pesce, e di conseguenza, i terreni di coltura deve essere ottimizzato con sistemi tampone contenente valori fisiologicamente rilevanti per i pesci e la particolare specie di interesse. Questo protocollo descrive come preparare colture cellulari primarie da cadaveri medaka e includere le rettifiche dell’incubazione temperatura, osmolarità, pH e pH tampone apparato, oltre ad altri parametri importanti da considerare quando si prepara la cellula primaria culture da specie di mammiferi.