Vorbereitung einer qualitativ hochwertigen Primärzelle Kultur von Fisch Hypophysen

Zellkultur ist eines der wichtigsten Instrumente für die molekularbiologische Forschung, bietet eine ausgezeichnete Modellsystem für verschiedene biologische Fragen von normalen zellulären Physiologie bis hin zu Drogen-Screening und in der Karzinogenese¹. Primärzellen, direkt aus dem tierischen Gewebe mit enzymatischen und/oder mechanischen Methoden isoliert werden oft als mehr biologisch relevante als Zell-Linien wie die biologische Reaktion auf die in-Vivo -Situation näher sein kann. Protokolle für die Zubereitung von primären Zellkulturen sollten optimiert werden, für jede Spezies und Zelle Interesse um imitieren die Eigenschaften, die eine Zelle angepasst ist, und physiologisch sinnvolle Ergebnisse zu erzielen.

Zahlreiche Protokolle beschreiben Kulturbedingungen für Säugetier-Zelle Systeme, während ähnliche Protokolle beschreiben Primärkultur Bedingungen für Fisch-Zellen im Vergleich eher knapp sind. Zellen sind anfällig für schnelle Änderungen in Temperatur, pH-Wert und Osmolalität und sind besonders empfindlich bei der Dissoziation. Kommerzielle Salzlösungen und Kulturmedien verwendet für Säugetier-Zelle Kulturen sind nicht optimal für teleost Fische, vor allem in Bezug auf die pH-Puffer-Systeme und Osmolalität. Deshalb ist es wichtig, zu messen und passen die Lösungen an physiologisch relevanten Ebenen dieser Parameter in den Arten von Interesse.

Hypophyse Primärkulturen von mehreren teleost Fischarten, darunter Karpfen vorgenommen wurden (Cyprinus Carpio)^2,3, Rasen Karpfen (Ctenopharyngodon Idella)⁴, Goldfisch (Carassius Auratus )⁵, Regenbogenforelle (Oncorhynchus Mykiss)⁶, Europäischer Aal (Anguilla Anguilla)⁷, Tilapia (Oreochromis Mossambicus)⁸, Zebrafisch (Danio Rerio)⁹, und Atlantischer Kabeljau (Gadus Morrhua)¹⁰. Neben der Anpassung der Inkubationstemperatur auf die Arten von Interesse, haben einige dieser Protokolle der Zellen bei Säugetier-ähnlichen Bedingungen inkubiert, die möglicherweise für die Arten von Interesse, mit einem pH-Wert von 7,2 bis 7,5 in eine feuchte Atmosphäre suboptimale mit 3-5 % CO₂. Darüber hinaus ist es unklar, ob die Osmolalität von Lösungen für die Zubereitung verschiedener diese primären Zellkulturen angepasst wurden und zwischen verschiedenen Lösungen stabil.

Das aktuelle Protokoll basiert auf früheren Arbeiten mit Primärkulturen von Atlantischer Kabeljau¹⁰ und besteht aus Anpassungen der Inkubationstemperatur, Osmolalität, pH-Wert und pH-Puffer-Systeme, einschließlich der Partialdruck des Kohlendioxids (pCO₂), um die Physiologie des Medaka (O. Latipes). Medaka ist ein klein (3 – 4 cm) Süßwasserfisch, ursprünglich aus Ostasien. Heutzutage dient es als ein Modell-Arten in vielen Forschungslabors auf der ganzen Welt, da es relativ einfach zu züchten und sehr widerstandsfähig gegen viele gemeinsame Fisch Krankheiten¹¹ist. Es gibt mehrere Vorteile bei der Verwendung von Medaka als Vorbild, darunter eine Temperatur-Toleranz von 4 – 40 ° C¹¹, eine kurze Generationszeit, transparente Embryonen, ein Geschlecht-Bestimmung gen¹², und eine sequenzierte Genom¹³, sowie viele andere verfügbaren genetischen Ressourcen.

Die primäre Kulturbedingungen in diesem Protokoll werden optimiert, entsprechend der Temperatur von 26 ° C, die Medakas in der Fisch-Anlage gehalten werden. Darüber hinaus die Osmolalität von 320 mOsm/kg aus Atlantischer Kabeljau in Salzwasser bis 290 mOsm/kg für Medaka Leben im Süßwasser lebenden reduziert und steht im Einklang mit der normalen Osmolalität von Medaka Plasma¹⁴. Im Vergleich dazu ist die typische Osmolalität von Säugetieren Plasma im Bereich von 275-295 mOsm¹⁵. Fische leben in einer Vielzahl von Temperaturen und haben Kiemen, die in direktem Kontakt mit Wasser, so dass der pH und Puffer Kapazität des Blutes und der extrazellulären Flüssigkeit in den Fischen unterscheiden sich von denen bei Säugetieren sind. Säugetier-Kultur Medien umfassen in der Regel Puffersysteme, die einen pH-Wert von etwa 7,4 führen, wenn die Medien sind zu einem standard-Atmosphäre von 5 % CO₂ in befeuchtete Luft bei 37 ° c equilibriert Der pH-Wert ist temperaturabhängig und der Wert für pH-neutral (im Wasser) steigt mit abnehmender Temperatur¹⁶. Typische teleost Fische Plasma pH-Bereiche von 7,7 bis 7,9¹⁷. Die Optimierung dieses Protokolls enthalten eine Reduzierung von pH 7,85 für Kabeljau auf pH 7,75 für Medaka auf 26 ° C gehalten, durch die Erhöhung der CO₂ von 0,5 % bis 1 % bei 12 ° C gehalten.

Darüber hinaus unterscheidet sich die Bicarbonat-Pufferkapazität in Fischen und Säugetieren. CO₂ ist leicht über die Kiemen bei Fischen ausgetauscht und die pCO₂ im Wasser ist nur ein kleiner Bruchteil des pCO₂ in der Lunge-¹⁸. Entweder die Temperatur oder die pCO₂ ändert pH und Puffer des Mediums ändern. Weder den pH-Wert noch die pCO₂ empfohlen für die Inkubation von Säugerzellen deshalb optimal für Fisch-Zellen, und daher sollte die Nährmedien mit Puffersysteme, die physiologisch relevanten Werte für Fische optimiert werden und die bestimmte Arten von Interesse. Dieses Protokoll beschreibt die primären Zellkulturen von Medaka Hypophysen vorzubereiten und umfassen Anpassungen der Inkubation Osmolalität, Temperatur, pH-Wert und pH Puffersystem, neben anderen wichtigen Parameter, die bei der Vorbereitung der Primärzelle Kulturen von nicht-Säugetier-Arten.