Préparation d’une Culture de cellules primaires de haute qualité de poisson hypophyses

Culture cellulaire est l’un des principaux outils utilisés dans la recherche en biologie moléculaire, grâce à un système excellent modèle pour répondre à des questions biologiques différentes allant de la physiologie cellulaire normale à drogues dépistage et carcinogenèse¹. Les cellules primaires, prélevés directement les tissus d’origine animale par des méthodes enzymatiques et/ou mécaniques, sont souvent considérés comme biologiquement plus pertinentes que les lignées cellulaires comme la réaction biologique peut se rapprocher de la situation in vivo . Protocoles pour la préparation de cultures de cellules primaires doivent être optimisés pour chaque type d’espèces et de cellules d’intérêt afin de reproduire les caractéristiques auxquelles une cellule est adaptée et obtenir des résultats significatifs physiologiquement.

Nombreux protocoles décrivent les conditions de culture pour les systèmes cellulaires de mammifères, tandis que les protocoles similaires, décrivant les conditions de culture primaire de cellules de poissons sont plutôt rares en comparaison. Les cellules sont vulnérables aux changements rapides de température, le pH et l’osmolalité et sont particulièrement fragiles lors de la procédure de dissociation. Commerciales solutions salines et milieux de culture utilisés pour les cultures de cellules de mammifères ne sont pas optimaux pour les poissons téléostéens, surtout en ce qui concerne les systèmes tampon de pH et l’osmolalité. Par conséquent, il est important de mesurer et d’ajuster les solutions aux niveaux physiologiquement pertinents de ces paramètres chez les espèces d’intérêt.

Les cultures primaires hypophysaires ont été apportées de plusieurs espèces de poissons téléostéens, notamment la carpe commune (Cyprinus carpio)^2,3, herbe la carpe herbivore (Ctenopharyngodon idella)⁴, cyprin doré (Carassius auratus )⁵,⁶de la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss), l’anguille européenne (Anguilla anguilla)⁷, le tilapia (Oreochromis mossambicus)⁸, poisson zèbre (Danio rerio)⁹, et Morue de l’Atlantique (Gadus morhua)¹⁰. Mis à part le réglage de la température d’incubation de l’espèce d’intérêt, plusieurs de ces protocoles ont incubé les cellules de mammifères comme conditions pouvant être sous-optimale pour les espèces d’intérêt, avec un pH de 7,2 à 7,5 en atmosphère humidifiée contenant de 3 à 5 % de CO₂. En outre, il est difficile de savoir si l’osmolalité des solutions utilisées pour la préparation de plusieurs de ces cultures de cellules primaires ont été ajustée et stable entre différentes solutions.

Le protocole actuel repose sur des travaux antérieurs avec des cultures primaires de morue de l’Atlantique¹⁰ et comprend les réglages de la température d’incubation, osmolalité, pH et pH tampon systèmes, y compris la pression partielle de dioxyde de carbone (pCO₂), à la physiologie des médakas (o. latipes). Chez les sujets exposés sont un poisson d’eau douce de petite taille (3 à 4 cm), originaire d’Asie du sud-est. Ces jours-ci, il est utilisé comme une espèce de modèle dans de nombreux laboratoires de recherche dans le monde entier, car il est relativement facile à reproduire et très résistants à beaucoup de maladies poisson commun¹¹. Il y a plusieurs avantages à utiliser des médakas comme modèle, y compris une tolérance à la température de 4 à 40 ° C¹¹, un temps de génération court, embryons transparents, un déterminant le sexe génétique¹²et un génome séquencé¹³, ainsi que plusieurs autres ressources génétiques disponibles.

Les conditions de culture primaire dans le présent protocole sont optimisées pour correspondre à la température de 26 ° C régressées conservés à dans l’usine de poisson. En outre, l’osmolalité est ramenée de 320 mOsm/kg de morue vivant dans l’eau salée à 290 mOsm/kg pour le médaka vivant en eau douce et est conforme à l’osmolarité normale de medaka plasma¹⁴. En comparaison, l’osmolalité typique du plasma chez les mammifères est de l’ordre de 275 – 295 mOsm¹⁵. Poisson vit dans une variété de températures et ont des branchies qui sont en contact direct avec l’eau, ce qui rend la capacité de pH et de la mémoire tampon du sang et de liquide extracellulaire chez les poissons différentes de celles des mammifères. Milieux de culture chez les mammifères comprennent généralement des systèmes tampons qui permettent à un pH d’environ 7,4 lors les médias soient équilibrés à une atmosphère standard de 5 % de CO₂ dans l’air humidifié à 37 ° C. Le pH est dépendante de la température et la valeur de pH neutre (en eau) augmente avec une baisse de température¹⁶. Typique de poissons téléostéens plasma pH varie de 7,7 à 7,9¹⁷. L’optimisation du présent protocole notamment une diminution de pH 7,85 cabillaud conservées à 12 ° C à un pH de 7,75 pour médaka maintenue à 26 ° C en augmentant le CO₂ de 0,5 % à 1 %.

En outre, la capacité de tampon bicarbonate est très différente dans les poissons et les mammifères. CO₂ est facilement échangés sur les branchies chez les poissons et le BCP₂ dans l’eau n’est qu’une petite fraction du pCO₂ dans le poumon¹⁸. Changement de la température ou la pCO₂ va changer le pH et le tampon du milieu. Par conséquent, ni le pH ni la pCO₂ suggérés en incubant les cellules de mammifères est optimal pour les cellules de poissons, et par conséquent, les milieux de culture doit être optimisée avec des systèmes tampons qui contiennent des valeurs physiologiquement pertinents pour les poissons et les espèce d’intérêt. Ce protocole décrit comment préparer des cultures de cellules primaires de glandes pituitaires médaka et inclut les ajustements de la système d’incubation température, osmolalité, pH et pH tampon, en plus d’autres paramètres importants à considérer lors de la préparation de cellules primaires cultures des espèces non mammifères.