Количественная оценка Efferocytosis по микроскопии флуоресцирования одноклеточного

Apoptosis или запрограммированная смерть клетки, является высоко регулируется физиологический процесс, который происходит в большинстве многоклеточных организмов и имеет решающее значение для их развития и гомеостаза¹. Помимо участия в нормальной клетки оборота и эмбрионального развития, апоптоз позволяет ликвидации зараженных или поврежденных клеток тканей и может срабатывать в ответ на инфекции, воспаления, рак, а также медицинских вмешательств Например, лучевой терапии или стероидов¹. Apoptotic клетки разоблачить «едят-me» сигналы на их поверхности клетки, которые признаны рецепторов на широкий спектр профессиональных и непрофессиональных фагоцитов, именуемые далее «efferocytes». Участие этих рецепторов вызывает поглощения и деградации apoptotic клетки, efferocyte через процесс, известный как efferocytosis^2,3. Фосфатидилсерин лучше всего характеризуется едят-мне сигнал вождения efferocytosis. Обычно ограничивается внутренним листовка плазматической мембраны, с apoptosis, активация скрамблаза липидов, которая нарушает этой асимметрии мембраны, тем самым подвергая Фосфатидилсерин на поверхности клеток⁴. Фосфатидилсерин находится на поверхности внеклеточного-apoptotic клеток, таких как зрелые макрофаги и активации тромбоцитов. Однако эти клетки являются не efferocytosed из-за присутствия «не ешь меня» сигналов, таких как CD47, на их клеток поверхности^5,6,7. Подвергаются Фосфатидилсерин признается массив efferocytic рецепторов, выраженную efferocytes. Связывание этих рецепторов к Фосфатидилсерин, либо непосредственно, либо через помощи опсонины, активирует сигнальных путей, способствующих сплошным apoptotic клеток в вакуоль мембраны прыгните называют efferosome^{8, 9 , 10 , 11 , 12}. efferosome предохранители последовательно с endosomes и лизосомы, которые доставляют молекулярный механизм, необходимый для подкислять efferosome и ухудшить apoptotic клетки грузов^13,14. После того, как деградация, apoptotic клеток производные материалы продаются в утилизации endosome — процесс, который ограничивает иммунных реакций к apoptotic клеток антигены, и которая может позволить для восстановления питательных веществ из клетки apoptotic^{13, 15}. Неудача в efferocytosis результаты в нарушение Распродажа apoptotic клеток; в конечном итоге эти необезвреженные клетки претерпевают вторичные некрозы. Отмершие клетки релиз про воспалительных цитозольной содержимое, патогенов и autoantigens в внеклеточной окружение, таким образом, движущей широкий спектр инфекционный, воспалительных и аутоиммунных заболеваний^16,17. Вместе, апоптоз и efferocytosis облегчить удаление мертвых и умирающих клеток и для поддержания гомеостаза ткани.

Изучение молекулярных механизмов лежащих в основе efferocytosis требует методы, которые обеспечивают четкую количественную оценку apoptotic клеток поглощения. Эта количественная оценка осложняется тем, что в отличие от других поглощения таких механизмов, как эндоцитоза и фагоцитоз^18,19, efferocytosis не может привести к сплошным нетронутыми целевой ячейки, в результате частичного поглощения apoptotic клетки efferocyte²⁰. Протокол, описываемые описывает в пробирке efferocytosis assay который обеспечивает точное разграничение интернализированных против-внутреннюю часть индивидуальных apoptotic клеток и могут быть объединены с целым рядом-клеток и микроскопия живой клетки подходы. Традиционные фагоцитоза анализов добавить антитела специфические фагоцитарной цели в конце эксперимента для того, чтобы называть не учитываются цели, где наш метод отличается маркировки apoptotic цель с ковалентно связан биотина^{21 , 22}. в то время как apoptotic клеток специфические антитела могут использоваться в этом assay, biotinylation подход позволяет для любого целевого белка подшипник быть помечены и избегает потенциальных проблем с перекрестной реактивности вторичные антитела, если выполняется иммуноокрашивания . В частности мы наметим подготовки apoptotic клеток Jurkat, которые были двойной окрашенных клеток отслеживания красителя и биотин. Ячейка, отслеживания краситель позволяет для apoptotic клеток, полученных материалов быть считано во время efferocytosis, тогда как поверхности biotinylation позволяет для дискриминации внутреннюю от-внутреннюю часть efferocytosed apoptotic клеток. Мы также описывают культуру и подготовка J774.2 и THP-1 клеточных линий для использования в качестве мышиных и человеческого efferocytes, моноцитарных м2 макрофагов в качестве примера главной ячейки efferocytosis, и Jurkat клетки для использования как efferocytic целей. Эти методы легко может применяться для других клеточных линий или первичной клетки, клетки-мишени любой форме клеточной смерти (например апоптоза, некроз и necroptosis) и имитирует микронного размера, имитирующие apoptotic клетки через липидного покрытия или покрытие с лигандами, специфичные для efferocytic рецептор интерес.

Метод, изложенные в настоящем Протоколе имеет ряд преимуществ над методами цитометрии на основе потока, широко используется в области^23,24. Непосредственно визуализации фагоцитарной apoptotic клеток взаимодействия, в сочетании с четкой маркировки как общая и не учитываются apoptotic клеток материала, можно сделать количественные показатели efferocytosis. Кроме того использование рН нечувствительным флуорофоров ограничивает отягощающих факторов, таких, как подавление FITC и GFP флуоресценции в лизосомальных рН, который смешивает некоторые альтернативные методы²⁵. И наконец, хотя не подробно, эти методы могут быть использованы с помощью efferocytes, выражая дневно меченых трансгенов, или с иммуноокрашивания после фиксации, для количественной оценки сигнальные молекулы деятельность и мониторинг клеточные процессы во время efferocytosis.