Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

Apoptosis of geprogrammeerde celdood, is een sterk gereguleerd fysiologische proces dat voorkomt in de meeste meercellige organismen en is van cruciaal belang voor hun ontwikkeling en homeostase¹. Naast betrokkenheid bij normale cel omzet en embryonale ontwikkeling, apoptosis kan de verwijdering van geïnfecteerde of beschadigde cellen van weefsels en kan worden geactiveerd in reactie op de infectie, ontsteking, kanker, en ook door medische ingrepen zoals radiotherapie of steroïden¹. Apoptotic cellen bloot “eten-me” signalen op hun celoppervlak die worden herkend door receptoren op een scala aan professionele en niet-professionele fagocyten, gezamenlijk aangeduid als “efferocytes”. Betrokkenheid van deze receptoren induceert de opname en afbraak van de apoptotic cel door de efferocyte door middel van een proces dat bekend staat als efferocytosis^2,3. Fosfatidylserine is het beste gekarakteriseerd eten-me signaal drijvende efferocytosis. Het is normaliter beperkt tot de innerlijke bijsluiter van het plasma-membraan, met een lipide-scramblase die dit membraan asymmetrie verstoort, dus bloot fosfatidylserine op de oppervlakte van cel⁴activeren apoptosis. Fosfatidylserine is te vinden op het extracellulaire oppervlak van sommige niet-apoptotic cellen, zoals volwassen macrofagen en bloedplaatjes geactiveerd. Deze cellen zijn echter niet efferocytosed als gevolg van de aanwezigheid van “don’t eat me” signalen, zoals CD47, op hun cel oppervlakte^5,6,7. Blootgestelde fosfatidylserine wordt herkend door een matrix van efferocytic receptoren uitgedrukt door efferocytes. Binden van deze receptoren aan fosfatidylserine, activeert ofwel rechtstreeks ofwel via de hulp van opsonins, signaalroutes ter bevordering van de engulfment van de apoptotic cel in een membraan-gebonden vacuole genoemd de efferosome^{8, 9 , 10 , 11 , 12}. de efferosome zekeringen opeenvolgend met Endosomen en lysosomes, die de moleculaire machines nodig breng het efferosome te leveren te degraderen de apoptotic cellen lading^13,14. Zodra gedegradeerd, de apoptotic cel-afgeleide materialen worden verhandeld aan de recycling endosome — een proces die grenzen immuunresponsen aan apoptotic cel-afgeleide antigenen, en die kunnen toestaan voor de terugwinning van voedingsstoffen uit de apoptotic cellen^{13, 15}. Een storing in efferocytosis resulteert in verminderde Goedkeuringvande apoptotic cellen; Deze onontgonnen cellen ondergaan uiteindelijk secundaire necrose. Necrotische cellen introductie pro-inflammatoire cytosolische inhoud, pathogenen en autoantigens in de extracellulaire milieu, dus een drivingrange van besmettelijke, inflammatoire en auto-immune ziekten^16,17. Samen, apoptosis en efferocytosis de opheffing vergemakkelijkt van de stervende en dode cellen en zorgen voor het onderhoud van de weefsel homeostase.

Onderzoek naar de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de efferocytosis vereist methoden waarmee een duidelijke kwantificering van apoptotic cellen opname. Deze kwantificering wordt bemoeilijkt door het feit dat in tegenstelling tot andere opname mechanismen zoals endocytose en fagocytose^18,19, efferocytosis niet leiden de engulfment van intact doelcel tot kunnen, resulterend in de versnipperde opname van de apoptotic cel door de efferocyte²⁰. Het protocol hierin beschreven beschrijft een in vitro efferocytosis bepaling waarmee nauwkeurige afbakening van de verinnerlijkte versus niet-geïnternaliseerd gedeelten van individuele apoptotic cellen en kan gecombineerd worden met een aantal vaste-cel en Live-cel microscopie benaderingen. Traditionele fagocytose assays toevoegen antilichamen die specifiek zijn voor de fagocytische doelgroep op het einde van het experiment om het label niet-geïnternaliseerd doelen, waar als onze methode verschilt door etikettering van het doel van de apoptotic met biotine covalent alternerende^{21 , 22}. terwijl apoptotic cel specifieke antilichamen kunnen worden gebruikt in deze test, de biotinylation aanpak zorgt voor geen eiwithoudende doelstelling worden gelabeld en vermijdt potentiële problemen met secundair antilichaam Kruisallergie als immunokleuring wordt uitgevoerd . Specifiek, duidelijk naar voren komt de voorbereiding van apoptotic Jurkat cellen, die dual-gekleurd met zowel een cel bijhouden kleurstof en biotine zijn. De cel voor het bijhouden van kleurstof zorgt voor apoptotic cel-afgeleide materialen worden bijgehouden tijdens de efferocytosis, terwijl de oppervlakte biotinylation zorgt voor de discriminatie van geïnternaliseerd van niet-geïnternaliseerd delen van efferocytosed apoptotic cellen. Ook beschrijven we de cultuur en de voorbereiding van J774.2 en THP-1 cellijnen voor gebruik als lymfkliertest en menselijke efferocytes, monocyt-afgeleide M2 macrofagen als een voorbeeld van de primaire cel efferocytosis en Jurkat cellen voor gebruik als efferocytic doelen. Deze methoden kunnen eenvoudig worden toegepast op andere cellijnen of primaire cellen, doelcellen ondergaat elke vorm van celdood (bijvoorbeeld apoptosis, necrose en necroptosis) en micron-sized nabootsers die simuleren van apoptotic cellen via lipide coatings of coating met liganden specifieke aan een receptor efferocytic van belang.

De methode geschetst in dit protocol kent verschillende voordelen ten opzichte van de stroom cytometry gebaseerde methoden gewoonlijk worden gebruikt in het veld^23,24. Door direct imaging de fagocytensysteem-apoptotic cel interactie, gecombineerd met duidelijke etikettering van beide totale en niet-geïnternaliseerd apoptotic cel materiaal, kunnen kwantitatieve metingen van efferocytosis worden gemaakt. Bovendien beperkt het gebruik van pH-ongevoelig fluorophores storende factoren zoals de onderdrukking van FITC en GFP fluorescentie bij lysosomale pH dat kunstdiscours sommige alternatieve methoden²⁵. Tot slot, terwijl niet in detail beschreven, deze methoden kunnen worden ingezet met behulp van uiten van fluorescently-label transgenen, efferocytes of met na fixatie immunokleuring, met het oog op kwantificering van de activiteit van de molecule signalering en monitoring van de cellulaire processen tijdens efferocytosis.