التحديد الكمي افيروسيتوسيس بالفحص المجهري Fluorescence خلية واحدة

المبرمج، أو موت الخلية المبرمج، هو الغاية-وينظم عملية فسيولوجية التي تحدث في معظم الكائنات الحية متعددة الخلايا، وهو أمر حاسم ل التنمية والتوازن على¹. بالإضافة إلى اشتراكها في دوران الخلية الطبيعية والتنمية الجنينية، المبرمج يمكن القضاء على الخلايا المصابة أو التالف من الأنسجة ويمكن أن تسبب استجابة للعدوى، والتهاب، والسرطان، وأيضا بالتدخلات الطبية مثل العلاج بالأشعة أو المنشطات¹. الكشف عن الخلايا أبوبتوتيك “أكل-لي” إشارات على سطحها الخلية التي تعترف بها مستقبلات على طائفة من البالعات المهنية وغير المهنية، يشار إليها باسم “افيروسيتيس”. مشاركة هذه المستقبلات الحث على الإقبال وتدهور الخلية أبوبتوتيك التي افيروسيتي من خلال عملية تعرف باسم افيروسيتوسيس^،من²³. فوسفاتيديلسيريني هو الأفضل تتسم أكل-لي إشارة افيروسيتوسيس القيادة. عادة ما تقتصر على النشرة الداخلية من غشاء البلازما، مع المبرمج تفعيل سكرامبلاسي دهن الذي يعطل هذا التفاوت الغشاء، مما يعرض فوسفاتيديلسيريني على سطح الخلية⁴. ويوجد على سطح بعض الخلايا غير أبوبتوتيك، مثل الضامة الناضجة خارج الخلية فوسفاتيديلسيريني وتنشيط الصفائح الدموية. ومع ذلك، ليست هذه الخلايا افيروسيتوسيد بسبب وجود إشارات “لا يأكلون لي”، مثل CD47، في تلك الخلية السطحية^5،6،7. فوسفاتيديلسيريني المكشوفة المسلم من صفيف مستقبلات افيروسيتيك أعرب عن طريق افيروسيتيس. ملزم لهذه المستقبلات إلى فوسفاتيديلسيريني، أما مباشرة أو من خلال المعونة من أوبسونينس، ينشط مسارات الإشارات التي تعزز الإحاطة الخلية apoptotic إلى المنقبضة غشاء زمنياً وصف افيروسومي^{8، 9 , 10 , 11 , 12}-افيروسومي الصمامات تسلسلياً مع اندوسوميس و lysosomes، التي توفر الآلية الجزيئية الضرورية أسيديفي في افيروسومي وتتحلل في أبوبتوتيك الخلية الشحن^13،14. مجرد المتدهورة، يتم الاتجار بالمواد المستمدة من الخلايا أبوبتوتيك إلى دخلول إعادة التدوير – عملية مما يحد من الاستجابات المناعية المستضدات المشتقة من الخلايا أبوبتوتيك، والتي قد تسمح لاسترداد المواد الغذائية من خلية أبوبتوتيك^{13، 15}. فشل في نتائج افيروسيتوسيس في إزالة البصر من الخلايا أبوبتوتيك؛ تخضع هذه الخلايا التي لم تتم إزالتها في نهاية المطاف نخر الثانوية. نخرية الخلايا الإفراج عن محتويات سيتوسوليك برو–التهابات ومسببات الأمراض، وأوتوانتيجينس في الوسط خارج الخلية، وهكذا يقود مجموعة من الأمراض المعدية والالتهابات والمناعة الذاتية^16،17. معا، المبرمج وافيروسيتوسيس تيسير إزالة خلايا الموت والميت والسماح للحفاظ على التوازن الأنسجة.

يتطلب التحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء افيروسيتوسيس الأساليب التي تتيح إجراء تقييم كمي واضح لامتصاص الخلية أبوبتوتيك. هذا التحديد الكمي معقد من حقيقة أنه خلافا لامتصاص أخرى لا ينتج آليات مثل الالتقام والبلعمه^،من¹⁸¹⁹، افيروسيتوسيس في الإحاطة للخلية الهدف سليمة، أدى إلى استيعاب تدريجي خلية أبوبتوتيك افيروسيتي²⁰. البروتوكول الموضحة هنا وصف في المختبر افيروسيتوسيس مقايسة التي توفر ترسيم دقيق المدخلة مقابل عدم استيعاب أجزاء من الخلايا الفردية أبوبتوتيك ويمكن دمجها مع مجموعة متنوعة من خلايا ثابتة و النهج مجهرية تعيش الخلية. فحوصات البلعمه التقليدية إضافة أجسام مضادة محددة الهدف متجولة في نهاية هذه التجربة من أجل تسمية أهدافا غير مستوعبة، حيث أنه لدينا أسلوب يختلف عن طريق الوسم الهدف أبوبتوتيك مع البيوتين مرتبطة تساهميا^{21 , 22}-بينما apoptotic الخلية أجسام مضادة محددة يمكن أن تستخدم في هذا التحليل، النهج بيوتينيليشن الذي يسمح لأي هدف الحاملة للبروتين يكون المسمى ويتجنب المشاكل المحتملة مع الجسم المضاد الثانوي ه إذا أجرى إيمونوستينينج . على وجه التحديد، فإننا مخطط إعداد الخلايا جوركات أبوبتوتيك التي كانت ملطخة المزدوج مع كل خلية تتبع صبغ والبيوتين. خلية تتبع صبغة يسمح للمواد المستمدة من الخلايا apoptotic تعقبها أثناء افيروسيتوسيس، بينما يسمح بيوتينيليشن السطحية للتمييز لاستيعابه من الأجزاء غير مستوعبة من الخلايا أبوبتوتيك افيروسيتوسيد. كما يصف لنا في الثقافة وإعداد خطوط الخلايا J774.2 و THP-1 للاستخدام افيروسيتيس مورين والبشرية، والمشتقة من الوحيدات الضامة M2 كمثال على افيروسيتوسيس الخلايا الأولية والخلايا جوركات لاستخدامها كأهداف افيروسيتيك. يمكن بسهولة تطبيق هذه الأساليب على خطوط الخلية أو الخلايا الأولية، إلى خلايا الهدف تمر بأي شكل من موت الخلية (مثل المبرمج ونخر نيكروبتوسيس)، وإلى يقلد ميكرون الحجم التي تحاكي apoptotic الخلايا عن طريق الطلاء الدهني أخرى أو طلاء مع يغاندس محددة لمستقبلات افيروسيتيك اهتمام.

الطريقة المبينة في هذا البروتوكول له العديد من المزايا التدفق الخلوي على أساس الأساليب استخداماً في الميدان^23،24. قبل التصوير مباشرة التفاعل خلية بلعمية-أبوبتوتيك، جنبا إلى جنب مع وضع العلامات واضحة كل المواد خلية apoptotic التام وغير مستوعبة، يمكن إجراء قياسات كمية افيروسيتوسيس. وعلاوة على ذلك، يحد استخدام fluorophores غير متحسسة للأس الهيدروجيني العوامل المؤثرة الأخرى مثل قمع fluorescence فيتك والتجارة والنقل على درجة الحموضة الليزوزومية أن يفند بعض الأساليب البديلة²⁵. وأخيراً، حين لا يصف بالتفصيل، هذه الأساليب يمكن أن تستخدم باستخدام افيروسيتيس الإعراب عن المتسلسلات المسمى فلوريسسينتلي، أو مع إيمونوستينينج بعد انتهاء التثبيت، للسماح للتحديد الكمي ليشير إلى نشاط الجزيء ورصد العمليات الخلوية أثناء افيروسيتوسيس.