Uso del trapianto di cellule staminali ematopoietiche per valutare l'origine della sindrome Myelodysplastic
Summary
Descriviamo l’uso del trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT) per valutare il potenziale maligno delle cellule emopoietiche geneticamente. HSCT è utile per valutare varie cellule ematopoietiche maligne in vivo , nonché generando un’ampia coorte di topi con sindromi mielodisplastiche (MDS) o leucemia per valutare nuove terapie.
Abstract
Sindromi mielodisplastiche (SMD) sono un gruppo eterogeneo di disordini di cellule staminali ematopoietiche che sono definiti da ematopoiesi inefficace, sangue periferico citopenie, displasia e una propensione per la trasformazione in leucemia acuta. Topi transgenici NUP98-HOXD13 (NHD13) ricapitolano MDS umano in termini di sangue periferico citopenie, displasia e trasformazione in leucemia acuta. Precedentemente abbiamo dimostrato che MDS può essere trasferito da un topo geneticamente ingegnerizzato con MDS ai destinatari di selvaggio-tipo di trapianto di cellule di midollo osseo nucleata MDS (BMNC). Più chiaramente capire la cella MDS di origine, abbiamo sviluppato approcci di trapiantare specifici, immunophenotypically definito sottoinsiemi ematopoietici. In questo articolo, descriviamo il processo di isolamento e di trapianto di specifiche popolazioni di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici. A seguito di trapianto, descriviamo gli approcci per valutare l’efficacia del trapianto e la persistenza delle cellule MDS del donatore.
Introduction
Le sindromi mielodisplastiche (MDS) rappresentano un gruppo eterogeneo di disordini clonali sangue caratterizzati da ematopoiesi inefficace, prova morfologica della displasia e una propensione per la trasformazione in leucemia mieloide acuta (AML)1,2 ,3,4. Ematopoiesi inefficace è riconosciuto come un arresto di maturazione nel midollo osseo e risultati nel sangue periferico citopenie nonostante un1,di midollo osseo ipercellulare3. L’incidenza di MDS è stato variamente stimato di 2-12 casi ogni 100.000 persone ogni anno negli Stati Uniti, e l’incidenza di MDS aumenta con l’età, rendendo questo una condizione importante per capire dato l’invecchiamento US popolazione3, 5. Anche se la maggior parte dei casi di MDS non hanno nessuna eziologia libera, alcuni casi di MDS sono probabilmente dovuto l’esposizione agli agenti genotossici noti, inclusi i solventi come benzene e cancro chemioterapia6.
Pazienti con sindromi mielodisplastiche hanno in genere acquisito mutazioni in cellule MDS7. Anche se relativamente raro, un numero di pazienti con sindromi mielodisplastiche hanno acquisito le traslocazioni cromosomiche bilanciate che coinvolgono geni quali NUP98, EVI1, RUNX1 e MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). Il nostro laboratorio ha un interesse profondo traslocazioni cromosomiche, che coinvolgono il gene NUP988. Topi transgenici che esprimono un transgene NUP98-HOXD13 (NHD13) regolato dal promotore Vav1 e gli elementi enhancer di visualizzare tutte le caratteristiche chiave di MDS, compreso il sangue periferico citopenie, prova morfologica della displasia e la trasformazione di AML9 .
Sebbene MDS sono stati riconosciuti per oltre 60 anni10e sono considerati come un disordine clonale della cellula formativa, gli sforzi per attecchire cellula umana di MDS in topi immunodeficienti sono stati in gran parte infruttuosi, perché le cellule MDS integrano scarsamente11, 12,13,14 e i topi non sviluppano la malattia clinica. Nel tentativo di identificare quali cellule ematopoietiche possono trasmettere MDS, abbiamo girato per il modello di NHD13 e ha mostrato che noi potremmo interdigitate MDS come un’entità di malattia che ha mostrato tutti i segni cardinali di MDS umana, tra cui sangue periferico citopenie, displasia, e trasformazione da AML15. In questo rapporto, presentiamo i dettagli tecnici di questi esperimenti, nonché approcci ulteriormente frazionare ematopoietiche staminali e cellule del precursore (HSPC), nel tentativo di identificare cellule d’inizio di MDS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anche se MDS sono un disordine clonale di cellule staminali ematopoietiche, il MDS “gambo”, o cellule di origine, non sono ancora state caratterizzate. Precedentemente abbiamo dimostrato che MDS possono essere transplantable ai topi WT usando il midollo osseo dai topi NHD13 di HSCT, caratterizzata da anemia macrocitica, leucopenia, neutropenia e prova morfologica della displasia15. Inoltre, analisi competitiva ripopolamento identificato un vantaggio di crescita delle cellule dal midollo osseo NHD1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca intramurale del National Cancer Institute, National Institutes of Health (concedere numeri ZIA SC 010378 e BC 010983).
Materials
| 14 mL round bottom tube | Falcon | 352057 | |
| Hank's balanced salt solution | Lonza | 10-527F | |
| Anti-CD45.2 antibody | Southern Biotech | 1800-15 | LOT# A077-T044O |
| 3 mL Syringe | Monoject | 8881513934 | |
| 27-G needle | BD | 305109 | |
| 20-G needle | BD | 305176 | |
| Lineage Cocktail | Miltenyi | 130-090-858 | LOT# 5170418221 |
| Anti-Biotin antibodies | Miltenyi | 130-113-288 | LOT# 5171109046 |
| 1 mL Syringe | Excelint | 26027 | Insulin Syringe |
| Heating Lamp | Thermo Fisher Scientific | E70001901 | |
| FACS machine | Cytec | FACScan | 2 lasers, 5 color detectors |
| FACS sorting instrument | Beckman Coulter | MOFLO ASTRIOS | 5 lasers, 23 parameters, 6 population sorting simulteneously |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Gamma Irradiator | Best Theratronics | Gammacell 40 | |
| Blood collection tube | RAM scientific | 76011 | |
| Recipient mice | Charles River | B6-LY5.1/Cr, CD45.1 | |
| NUP98-HOXD13 mice | n/a | C57Bl/6, CD45.2 | Colony maintained at NIH |
| 5 mL round bottom tube | Falcon | 352058 |
References
- Corey, S. J., et al. Myelodysplastic syndromes: the complexity of stem-cell diseases. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 118-129 (2007).
- Garcia-Manero, G. Myelodysplastic syndromes: 2015 Update on diagnosis, risk-stratification and management. American Journal of Hematology. 90 (9), 831-841 (2015).
- Heaney, M. L., Golde, D. W. Myelodysplasia. The New England Journal of Medicine. 340 (21), 1649-1660 (1999).
- Nimer, S. D. Myelodysplastic syndromes. Blood. 111 (10), 4841-4851 (2008).
- Aul, C., Giagounidis, A., Germing, U. Epidemiological features of myelodysplastic syndromes: results from regional cancer surveys and hospital-based statistics. International Journal of Hematology. 73 (4), 405-410 (2001).
- Pedersen-Bjergaard, J., Christiansen, D. H., Desta, F., Andersen, M. K. Alternative genetic pathways and cooperating genetic abnormalities in the pathogenesis of therapy-related myelodysplasia and acute myeloid leukemia. Leukemia. 20 (11), 1943-1949 (2006).
- Uy, G. L., et al. Dynamic changes in the clonal structure of MDS and AML in response to epigenetic therapy. Leukemia. 31 (4), 872-881 (2017).
- Gough, S. M., Slape, C. I., Aplan, P. D. NUP98 gene fusions and hematopoietic malignancies: common themes and new biologic insights. Blood. 118 (24), 6247-6257 (2011).
- Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. NUP98-HOXD13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
- Block, M., Jacobson, L. O., Bethard, W. F. Preleukemic acute human leukemia. Journal of the American Medical Association. 152 (11), 1018-1028 (1953).
- Thanopoulou, E., et al. Engraftment of NOD/SCID-beta2 microglobulin null mice with multilineage neoplastic cells from patients with myelodysplastic syndrome. Blood. 103 (11), 4285-4293 (2004).
- Kerbauy, D. M., Lesnikov, V., Torok-Storb, B., Bryant, E., Deeg, H. J. Engraftment of distinct clonal MDS-derived hematopoietic precursors in NOD/SCID-beta2-microglobulin-deficient mice after intramedullary transplantation of hematopoietic and stromal cells. Blood. 104 (7), 2202-2203 (2004).
- Benito, A. I., et al. NOD/SCID mice transplanted with marrow from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) show long-term propagation of normal but not clonal human precursors. Leukemia Research. 27 (5), 425-436 (2003).
- Medyouf, H., et al. Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit. Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).
- Chung, Y. J., Choi, C. W., Slape, C., Fry, T., Aplan, P. D. Transplantation of a myelodysplastic syndrome by a long-term repopulating hematopoietic cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14088-14093 (2008).
- Pietras, E. M., et al. Functionally Distinct Subsets of Lineage-Biased Multipotent Progenitors Control Blood Production in Normal and Regenerative Conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).
- Chung, Y. J., Fry, T. J., Aplan, P. D. Myeloablative hematopoietic stem cell transplantation improves survival but is not curative in a pre-clinical model of myelodysplastic syndrome. PLoS One. 12 (9), e0185219 (2017).
