体外自己組織化人工脂質膜上のタンパク質パターンの再構成

1. タンパク質の生産 蛋白質の表現 大腸菌BL21 を変換 (DE3) pLysS ミンク30や鉱山6 mRuby3 心24EGFP 心29心6の式のそれぞれのプラスミドを持つ。プラスミド マップの補足情報を参照してください。 それぞれの抗生物質 (例えば100 μ g/mL アンピシリンまたは 50 μ G/ml カナマイシン) を使用して単一コロニーの LB 培地で一晩培養を接種して揺れながら 14-16 h の 37 ° C で孵化させなさい。 一晩かけて培養 (希釈 1: 200) とそれぞれの抗生物質を含んでいる TB 媒体の 500 mL を接種して 180 rpm で揺れながら 37 ° C で文化を孵化させなさい。 文化 600 の光学濃度に達すると 0.5 mM IPTG を追加することでタンパク質の発現を誘導する 0.5 0.7 nm。EGFP 心や mRuby3 心の場合 16 ° C で培養する細胞をシフトし 14-16 h、ミンツ、心や鉱山の場合細胞の成長、誘導後の 37 ° C で 3-4 時間の細胞の成長します。注: 誘導ミンツ、心または鉱山の式は過剰発現細胞分裂の欠陥の結果として細胞の毒性したがって、37 ° C で培養時間が 4 時間以下に保たれることが重要です。多くのタンパク質が必要な場合は、文化はなく、インキュベーション時間の量を増やします。 それぞれの培養時間 10 分 4000 × g で遠心分離によって細胞を収穫し、-80 ° c まで細胞ペレットを格納後はさらに使用します。 蛋白質の浄化注: プレパックド Ni NTA 列自動タンパク質精製システム上またはを使用して Ni NTA ビーズ重力流ベンチ浄化のため、蛋白質を浄化することが。 プレパックド Ni 国税庁で列を含む自動タンパク質精製システム使用バッファー A1 (50 mM リン酸ナトリウム pH 8.0, 500 mM, 10 mM のイミダゾールの塩化ナトリウム)、バッファー B1 (50 mM リン酸ナトリウム pH 8.0、500 mM の NaCl、20 mM のイミダゾール) の精製およびバッファー C1 (50 mM ナトリウムリン酸塩 pH 8.0、500 mM の NaCl、250 mM のイミダゾール)。Ni 国税庁を使用して重力流ベンチ精製ビーズ バッファー A2 (トリス塩酸 pH 8.0 では、300 mM の NaCl、10 mM のイミダゾール 50 mM) を使用、バッファー B2 (50 mM トリス塩酸 pH 8.0 では、300 mM の NaCl、20 mM のイミダゾール) とバッファー C2 (50 mM トリス塩酸 pH 8.0 では、300 mM の NaCl、250 mM のイミダゾール)。補完すべてのバッファーを 10 mM β-メルカプトエタノールまたは 0.4 mM TCEP (使用前に還元剤として tris(2-carboxyethyl)phosphine)。 Mg2 +-ADP EDTA 無料プロテアーゼ阻害剤、100 μ g/mL リゾチーム 〜 250 U/mL DNase、0.2 mM を添加したバッファー A1 または A2 の 20-30 mL の細胞を再懸濁します (Mg2 +-ADP 心や EGFP 心浄化のみの場合 100 mM ADP から在庫の 100 mM MgCl2 pH は 7.5 に調整されます。) 先端の超音波発生装置を使用して細胞を溶解 (30 2.5 分、30 s パルス振幅 30% オフ s) 氷浴のセルを含むバイアルを維持しながら。 25,000 x g で 45 分と 4 ° C の溶解液の細胞を遠心分離によって細胞の残骸を削除します。 Ni NTA 列または Ni NTA ビーズに上澄みを孵化させなさい。 プレパックド Ni NTA 列の自動タンパク質精製システムのサンプル ポンプを使用して、列にサンプルをロードします。 ベンチ上の浄化、4 ° C で 1 時間の回転シェーカーで 50 mL の反応管内の Ni NTA ビーズ サンプルをインキュベートします。後続の手順では、25 mL のピペットを使用して空の列に Ni NTA ビーズを転送します。 少なくとも 5 列 A1 または A2 のバッファー量で洗います。 B1 または B2 のバッファーの少なくとも 5 列ボリュームで洗ってください。 C1 または C2 のバッファーが付いている蛋白質を溶離する。 SDS ページを介してタンパク質の純度を評価します。 オプション: ストレージ バッファー (50 mM HEPES/島 pH 7.2, 150 mM KCl、10% グリセロール、0.1 ミリメートルの EDTA、0.4 mM TCEP、(0.2 mM Mg2 +-ADP の心の場合)) のゲルろ過カラムにそれを適用することによってタンパク質をさらに浄化します。注: 集計タンパク質画分を削除する心のためには、ゲル濾過の使用をお勧めします。 ゲルろ過を採用してない場合交換 Ni NTA 溶出バッファー記憶域バッファー (50 mM HEPES/島 pH 7.2, 150 mM KCl、10% グリセロール 0.1 ミリメートルの EDTA、0.4 mM TCEP、心 (mM 0.2 Mg ADP)) に重力を使用した脱塩カラムの流れ (材料の表を参照してください)。 ショック-凍結因数で蛋白質液体窒素、-80 ° c 店でそれ以上の使用まで。 ブラッドフォードの試金を使用して蛋白質ストック濃度を測定し、atp アーゼ アッセイ20の蛋白質の活動を決定します。注: は 280 で吸収を用いたタンパク質濃度を評価できません nm。心の浄化中のヌクレオチドの存在と鉱山でトリプトファンの不足は、280濃度測定を歪めます。使用ブラッドフォードまたは BCA の代わりにタンパク質濃度を測定する試金します。 タンパク質ラベリング注: 鉱山を誘発する小さなタンパク質に蛍光タンパク質融合の主要な拡散プロパティと関数への変更それ故に、蛋白質 (システイン位置 51) の化学分類より優先されます蛍光タンパク質を融合。 DMSO (ジメチルスルホキシド) の 5-10 μ L のマレイミド色素共役の 0.125 mg を溶解し、揺れを 0.5 mL 鉱山 ph 7.2, ストレージ バッファーに分注上記の詳細を準備の下に追加。 4 ° C で一晩に 2 h または穏やかな揺れや攪拌下で RT で 2 時間インキュベートします。 別の染料とストレージ バッファー (50 mM HEPES/島 pH 7.2, 150 mM KCl、10% グリセロール 0.1 ミリメートルの EDTA、0.4 mM TCEP) と列を脱塩重力流れを使用して蛋白質。 さらにすべての未接続の色素を削除するには、余分なストレージ バッファーに対してタンパク質を dialyze します。 それぞれの色素の最大の絶滅を測定することによって成功したラベルを確認し、推定ラベル付け効率を計算します。ラベリングの程度を推定に関する詳細なプロトコルの染料メーカーの指示を参照してください。Sds-page 分析し、総質量によって質量分析サンプルの均質性とラベリングの成功についてさらに有益な情報を決定します。 2. 小型単層ベシクル (SUV) 準備 多重層膜ベシクルの生成 望ましい混合物の最終の SUV 巻クロロホルム lipid(s) の量を計算します。濃度は 4 mg/mL 分バッファー (25 mM トリス塩酸 pH 7.5、150 mM KCl、5 mM MgCl2) 脂質をする必要があります。標準的な最小の試金のための 7:3 DOPC:DOPG (mol %) 混合物の使用をお勧めします。大腸菌極性脂質を使用して抽出するときは、すべての準備手順の SLB バッファー (25 mM トリス塩酸 pH 7.5、150 mM KCl) を使用します。メモ: この混合物と同種 SLBs の生成は、はるかに困難な大腸菌極性脂質抽出を使用する初めてのユーザーの勧めがないです。 ガラスのヒントと肯定的な変位のピペットを使用して、1.5 mL ガラス瓶のクロロホルムで脂質をミックスします。 バイアルをゆっくりと回しながらわずかな窒素気流下における脂質を乾燥します。10 〜 20 分間強く窒素気流下における脂質を配置します。バイアル真空デシケータで乾燥した脂質膜を配置し、少なくとも 1 時間のための真空を適用します。 混合物が均一に不透明になるまで室温で最小バッファーで脂質を補給します。注: 多重層膜ベシクルから小さなベシクルの世代、脂質も押し出せる 2.2 で説明されているよう。または熱量 2.3 で説明されているようです。一般に、押出人工脂質膜の形成で助けることができる狭いサイズ分布が得られます。 押出成形による SUV 作製 脂質集計および多重構造を分解し、さらに 7 に 10 サイクルの凍結融解によって脂質可溶化します。 ホット プレート上 99 ° C に 70 の ° c の水でビーカーと液体窒素の容器を準備します。 窒素を停止沸騰するまで液体窒素で大きなピンセットでバイアルを保持します。お湯のソリューションは、完全に解凍するまでバイアルを転送します。脂質混合物は混合物によっての目にはっきり表示されるまでこの手順を繰り返します。 脂質の押出機を組み立てるし、事前分バッファーを使用してシステムをすすいでください。35、41 回 50 nm の細孔膜を介して脂質混合物を押し出します。膜は通過されない骨材を回避するパスの数が奇数に終了することを確認します。 Sonication によって SUV の準備 溶解ヒート ブロックのソリューションを含むガラスの瓶を置くバッファー内の脂質 37 ° C と渦を 20 分ごとに 1 分に設定します。約 1 時間の合計で孵化させなさい。 必要な高さでクランプ スタンドにバイアルをアタッチすることにより (この作業は 1.91 L、80 W) の超音波発生装置バースのバイアルの底を浸します。 バイアルを取り巻くソリューションが徹底的にパルスによって攪拌されるので、超音波発生装置のお風呂の水の高さを設定し、脂質混合物を約 20 分間超音波。脂質の明瞭さを評価することによって成功した超音波処理をチェックします。 Suv は一週間までの 4 ° C で保存または-20 ° c (~ 20 μ L) の小さい因数で冷凍し、数週間保存できます。バイアルまたは室温でチューブを解凍し、脂質二重層 (SLBs) はサポートの準備のための Suv を使用する前に、ソリューションがクリアされるまで、2.2.3 または 5.3 で説明したように再度超音波。ください Suv の狭いサイズ分布を用いて押出メモは、凍結とその後融解および超音波処理後失われます。 3. クリーニング ガラス Coverslips 注: クリーニング、ガラス coverslips の親水化同種と流体サポートされている脂質の重要な要因です。50% 過酸化水素 (3.1)、またはプラズマ クリーナー (3.2) で酸素プラズマを用いた比 7:2 硫酸から作られたピラニア溶液を用いたガラス coverslips を洗浄できます。両方のメソッドは、同じような結果をもたらします。 ピラニア coverslips のクリーニング ピラニア溶液を適用します。 逆ガラス シャーレまたは他の不活性の表面にガラス coverslips に配布します。ガラス ピペットでそれぞれ coverslip の中心に濃硫酸 (98%) の 7 が値下がりしましたを追加します。注意: 硫酸は強く酸性で腐食性です。適切な保護具のみとシリカフューム戸棚で作業します。 酸の滴の中に 50% 過酸化水素の 2 滴を追加します。注意: 過酸化水素は目や皮膚を腐食です。 反応をカバーし、少なくとも 45 分間インキュベートします。注: 最大の待機時間をここで実験の結果のために重要ではない、いくつかの日まで延長することができます。 洗浄ピラニア coverslips を掃除しました。 ピンセットを使用して個別に coverslips をピックアップし、超純水、酸を洗い流します。非スティック ホルダーまたは類似の輸送装置で洗浄 coverslips を配置します。 純水を広く各 coverslip をすすいで加圧ガス (窒素、空気オイルフリーする場合のみ) で表面を乾燥します。永久的なマーカーと、カバーガラスの洗浄面をマークします。 プラズマ洗浄 coverslips Coverslips 余分なエタノールとその後余分な純水をすすいでください。高圧ガスと coverslips を乾燥させます。4 で説明したように、商工会議所を組み立てます。 商工会議所アセンブリ 4 で説明したよう後添付を納めた coverslips とプラズマ プロセスのガスとして酸素とよりきれいに配置。きれいにプラズマを用いた coverslips (この作業 30% 電力 0.3 mbar 酸素圧 1 分を使用した)。SLB 形成プラズマ クリーニングの hydrophilizing 効果として前述の 5 では、切れる時間をかけて前に右の洗浄を行います。注: タイミングとプラズマ クリーニングの力をする必要があります少しすぎると蛍光に分類された膜を使用して最適化するまたは両方の不動膜や膜孔につながる過剰なプラズマ クリーニングすることができます。 4. チャンバー アセンブリ 鋭いハサミで切って、ふたをし、0.5 mL の反応管の円錐形の部品を破棄します。UV 接着剤をチューブの上部の縁に適用し、ピペット チップを使用して均等に配布します。 以前洗浄 coverslip 逆さまにチューブを接着します。ピラニア洗浄の場合、ガラスの洗浄面に接着することを確認します。360 nm ランプまたは 5 〜 15 分の LED の下に複数の部屋を配置することによって UV 接着剤を治します。 5. 脂質二分子膜 (SLB) 形成 予熱の熱は 37 ° c をブロックし、Min または SLB バッファー、商工会議所あたり 1 管 2 mL 反応管を孵化させなさい。 任意のほこりや UV 硬化とアセンブリの間に解決するかもしれない他の粒子を削除する組み立ておよび硬化の部屋に打撃窒素。プラズマきれいあなた coverslips ピラニア ソリューション (3.1) を掃除しているいない場合、3.2 で説明するように。熱ブロックでチャンバーを配置します。 エシェリヒア属大腸菌の極性脂質抽出物、0.53 mg/mL の作業濃度を降伏の場合 SLB バッファーまたはバッファー分の 130 μ で (4 mg/mL) で明確な脂質の 20 μ L 因数を希釈します。脂質は、凍結された場合に備えて風呂超音波発生装置にバッファーを追加する前に、チューブを保持することによって最初に超音波照射し、バッファーに再度超音波。 各チャンバーに脂質混合物の 75 μ L を追加し、タイマーを 3 分に設定 (ダイレクトオン/DOPG の混合物; 長い潜伏必要がありますその他の脂質混合物の)。エシェリヒア属大腸菌の極性脂質抽出の場合 3 mM の最終的な集中に商工会議所に CaCl2 100 mM の在庫からのピペットします。培養時間の間に、小胞は親水性のガラス表面にバーストしてコヒーレント SLB を形成するヒューズします。 60 秒後に、各商工会議所に 150 μ L 分バッファーを追加します。 洗浄室: 別 120 秒 (合計 3 分) 洗浄する各商工会議所分または SLB のバッファーの追加の 200 μ L を慎重にピペッティング ダウンを数回削除し、別の 200 μ L を追加後。 各商工会議所は、一度洗浄されている後 2 mL のバッファーが使用されるまで、最初の部屋を徹底的に洗うに進みます。SLBs の洗濯は商工会議所の動きの範囲を完璧にし正しい洗濯強度を見つけるいくつかの経験が必要です。注: は、SLB の乾燥を避けるためにチャンバーからすべての液体を取り外さないでください。注意: 洗浄の上に多くの追加要素によって異なりますが膜特性: 脂質の種類と製法、suv、脂質混合物で相対濃度表面処理とサポートの事前清掃します。 6. 自己組織化アッセイ タンパク質と ATP ソリューションの量を引いた 200 μ L 分のバッファーに商工会議所にバッファーのボリュームを調整し、私の心、心、ラベルを追加、に応じて、ミンツ。軽くピペッティングしてコンポーネントをミックスします。例の濃度は、1 μ M の心 (30% 添加した EGFP 心)、1 μ M 鉱山 (鉱山を化学的にラベル 10% 添加) と 0.05 μ M ・ ミンクがパターンを形成する濃度6,10,20,30の範囲で. だの自己組織化を開始するためには、(100 mM 100 mM MgCl2、pH 7.5 に ATP 在庫) から 2.5 mM ATP を追加します。注: 構成部品の追加 (心、私と ATP) の順序変えることができるし、最終的なパターン結果4に影響しません。 蛍光顕微鏡のだが自己組織化を観察 (材料の表を参照してください)。だが自己組織化は、全反射顕微鏡を用いた観察することも。EGFP 心をイメージング、488 nm アルゴン レーザーまたは匹敵するダイオード レーザー (例えば、 490 nm) を使用します。イメージング mRuby3-心、561 nm ダイオード レーザーを採用することをお勧めします。注: 高レベルを避けるため私たちと他の人より長い時間のための励起の17は、不可逆的なタンパク質重合膜をリードだがシステムで光毒性を観察しています。 7. PDMS の微細構造 注: PDMS (ポリジメチルシロキサン) は高分子の微細構造とマイクロ流体デバイスの生産のために使用できます。パターン化されたシリコンウエハーは、PDMS 構造を鋳造用の鋳型として機能します。PDMS 構造は SLB の形成のためのサポートとして機能し、セットアップを試金。 Microcompartments による si ウエハ写真平版を使用して自分自身を生成いずれか (詳しいプロトコル31または提供していますらビデオ プロトコル32のための Zieske および Schwille を参照) またはファウンドリからあなたの希望のシリコンウエハを注文.ここで使用されるウェーハのパターンの補足情報を参照してください。 PDMS 微細パターン化されたシリコン基板からの生産。 プラスチック製のカップを使用して、PDMS ベースと PDMS 架橋剤 1 g 10 g の重量を量る。いずれかを混ぜるとドガの PDMS 混合物または手動で、PDMS をミックスし、減圧し、その後に混合装置を使用します。 シリコン基板上の構造に直接 PDMS の小さな量をドロップするのにピペット チップを使用します。注: シリコン基板に傷を付けないように気をつけてください。 すぐに PDMS ドロップに #1 coverslip を置き、軽く押して、シリコンウエハ上に coverslip きれいなピペットの先端の上部の端を取る。Coverslip とシリコン基板間、PDMS が薄く広がっている必要があります。 オーブンに、coverslips にウェーハを配置、3 ~ 4 時間、PDMS を治すか、または 75 ° C で一晩ウェハをオーブンから除去し、室温まで冷ます。かみそりの刃を持つ SI ウェハから添付の PDMS の coverslip を慎重に取り外します。注: si ウェハの汚れや破損を得ることを防ぐために、常に PDMS 観察と微細構造をカバーします。ただし、PDMS の年齢の微細構造のひびの結果はそれゆえ、2 〜 3 週間より古い PDMS 構造を使用しません。 8. PDMS 微細構造の自己組織化 として商工会議所をアタッチする PDMS の微細構造と使用 coverslips 下 4 をについて説明します。 清潔で酸素プラズマ クリーナー 3.2.2 で説明したように表面を hydrophilize します。PDMS 基板上、ピラニア クリーンを行います。 前述の 6 未満だが自己組織化アッセイをセットアップします。 アッセイの設定後、正規だがパターン形成と蛍光顕微鏡を適切に形成された微細構造を確認します。 正規だがパターンが形成される (10-30 分) と、優しく上下のコンポーネントをミックスしてピペッティングして一歩一歩バッファーを削除 2 回ピペットします。100 μ L ピペットを使用してバッファーの大量削除し、10 μ L ピペットを使用して残りの部分を慎重に取り外します。注: この手順は、いくつかの練習を必要があります。やられてあまりにも多くのバッファー処理時間がかかりすぎる場合、微細構造、乾燥;もしあまりにも少しは取られ、蛋白質、微細構造では、限定されませんが、表面波の旅を。 すぐにチャンバー内に微細構造の残留バッファーの乾燥を避けるために蓋を閉じます。 撮像時間が長くできるように、チャンバー内スポンジ湿らせた作品をプラグインして蓋を閉じます。スポンジが、カバーガラスの表面に接触しないことを確認します。 表面微細構造だがパターン形成の上で停止して、バッファーが十分に低下した、表面微細構造チェックのイメージングの前に微細構造のイメージだが振動します。微細構造乾燥しないイメージング中に乾いていることを確認します。注: は、PDMS フォームのひびとして各使用後 microcompartments と coverslips を破棄します。 9. だがパターン形成過程の解析 波長、波速度および人工脂質平面膜のだが自己組織化の波プロファイルを定量化します。パッケージ化されたプラグインの標準的なセットでフィジーで基本的な分析33十分です。 Microcompartments ポール – 振動を分析するには、kymographs とタンパク質の時間平均濃度プロファイルを取得します。基本的な kymographs は、フィジーでの行の選択に沿って時系列を再スライスして取得できます。