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Biochemistry

In Vitro Reconstitution d’auto-organisationnelle profils protéiques sur bicouches lipidiques pris en charge

Published: July 28, 2018
doi:
10.3791/58139
, ,
1Department of Cellular and Molecular Biophysics,Max Planck Institute of Biochemistry

Summary

Nous fournissons un protocole pour in vitro tests d’auto-organisation de l’esprit et le mien sur une double couche lipidique pris en charge dans une chambre ouverte. En outre, nous décrivons comment placer le dosage microcompartments PDMS revêtu de lipides à reproduire in vivo des conditions de confinement de la réaction.

Abstract

Beaucoup d’aspects de l’organisation spatio-temporelle fondamentale des cellules est régies par des systèmes de réaction-diffusion. In vitro la reconstitution de ces systèmes permet pour des études détaillées de leurs mécanismes sous-jacents qui ne serait pas réalisables in vivo. Ici, nous fournissons un protocole pour la reconstitution in vitro du système MinCDE d’ Escherichia coli, qui positionne le septum de la division cellulaire dans le milieu cellulaire. Le dosage est conçu pour fournir uniquement les composants nécessaires à l’auto-organisation, à savoir une membrane, l’esprit de deux protéines et MinE et de l’énergie sous forme d’ATP. Nous fabriquons donc une chambre de réaction ouverte sur une lamelle couvre-objet, sur lequel se forme une bicouche lipidique pris en charge. La conception ouverte de la chambre permet une préparation optimale de la bicouche lipidique et contrôlée manipulation de la teneur en vrac. Les deux protéines, esprit et MinE, ainsi que ATP, est ensuite ajouté dans le volume en vrac au-dessus de la membrane. L’imagerie est possible par microscopies optiques beaucoup, comme supports de conception confocale, grand champ et microscope TIRF tant. Dans une variante du protocole, la double couche lipidique est formée sur un support à motifs, sur les microstructures PDMS en forme de cellule, au lieu de verre. Abaissement de la solution en vrac sur le bord de ces compartiments enferme la réaction dans un compartiment plus petit et prévoit des limites qui permettent imitant de in vivo le comportement oscillatoire. Pris ensemble, les auteurs décrivent des protocoles afin de reconstituer le système MinCDE avec et sans confinement spatial, permettant aux chercheurs de contrôler avec précision tous les aspects qui influencent la formation de modèles, tels que les plages de concentration et l’ajout d’autres facteurs ou de protéines et à augmenter systématiquement la complexité du système dans une configuration expérimentale relativement simple.

Introduction

Les patrons spatio-temporels sont essentielles dans la nature, régulation des tâches complexes tant au niveau cellulaire et multicellulaires, de morphogenèse réglementé la division cellulaire1,2. Les systèmes de réaction-diffusion jouent un rôle important dans l’établissement de ces modèles, mais ne sont pas encore bien compris. Un excellent exemple d’un système de réaction-diffusion et le meilleur système biologique caractérisé jusqu’à présent est l’Escherichia coli MinCDE système3,4,5,6,7. Le système MinCDE oscille du pôle de la cellule au pôle de la cellule chez e. coli pour déterminer le milieu de la cellule comme le site de la future division. Ce système repose sur l’esprit de l’ATPase, l’ATPase activation protéine MinE et la membrane comme une réaction spatiale matrice8. MinC ne fait pas partie du mécanisme de formation patron, mais est l’agent fonctionnel réel : un inhibiteur de la divisome principale protéine FtsZ5,6. MinC se lie à l’esprit et donc suit les oscillations, ce qui entraîne un gradient de concentration de protéine moyenne temporelle maximale aux pôles de la cellule et un minimum au milieu cellulaire, permettant seulement FtsZ polymériser à midcell9,10 . Le système de MinCDE fait partie de la grande famille des Walker A ATPases qui sont essentiels à l’organisation spatio-temporelle dans2de bactéries, de positionnement et de transport de protéines complexes plasmides de11 et12 et de régulation cellulaire Division13 et chromosome ségrégation14. Par conséquent, le système de réaction-diffusion MinCDE non seulement représente un système de réaction-diffusion archétypal, mais a aussi attiré l’attention en raison de sa pertinence pour l’organisation spatio-temporelle dans les bactéries.

Des études fonctionnelles détaillées du MinCDE system in vivo sont compliquées, comme la manipulation de la suppression de protéines et de gènes généralement entraîner des défauts de la division cellulaire. En outre, modifier la composition de la membrane ou les propriétés du cytosol in vivo est très difficile de15,16. Les changements au système et facteurs d’influence sont difficiles à interpréter dans l’environnement complexe de la cellule, plus encore si elle est perturbée dans une fonction essentielle en tant que la division cellulaire. Nous et autres avons donc tournée vers une démarche de reconstitution in vitro , de réduire le système à ses composantes de base : esprit, MinE, ATP comme source d’énergie et la prise en charge lipidique comme une réaction matrice6,17, 18. cette approche bottom-up permet de sonder le mécanisme de l’auto-organisation en détail sans la complexité d’une cellule vivante. La forme de protéines voyageant surface ondes6 et autres types de modèles17,19 dans ces conditions, quoique avec une longueur d’onde, qui est généralement une magnitude supérieure à in vivo. L’utilisation d’une chambre ouverte facilite un contrôle précis sur tous les aspects qui influent sur la formation du patron : les concentrations de protéine6, protéines propriétés20, membrane composition10, composition du tampon et concentration d’ATP 6, ainsi que l’ajout d’autres facteurs tels que le surpeuplement des agents21 et autres protéines de divisome22. En comparaison, la reconstitution in vitro du système MinCDE dans une cellule d’écoulement18,19,23 peut être utilisée pour sonder l’influence du débit17,23, protéine limiter les conditions19, membrane composition19 et entièrement en 3D accouchement18 sur les profils protéiques, mais restitue un contrôle exact de la concentration de protéine/composant et ajout de composant séquentielle beaucoup plus compliqué.

Utilisant cette chambre ouverte, nous inspire également le soutien des bicouches lipidiques planes par lequel on peut sonder comment géométriques limites influence modèle formation21, un phénomène qui a récemment été étudiée in vivo à l’aide de bactéries moulé en microstructures7. Nous avons également utilisé ce dosage pour étudier comment définis des mutations dans le mien affect formation du patron du système20. Par ailleurs, le même format de base de test a été employé pour étudier comment formation du patron peut être contrôlée par la lumière, introduction d’un peptide de MinE azobenzène-réticulé dans le dosage et d’imagerie avec TIRF microscopie24.

Nous avons constaté que, afin de reproduire le modèle MinDE formation observée in vivo dans un confinement de système, in vitro a été la clé. Utilisation de microcompartments en forme de bâtonnet, avec des dimensions ajustées à la longueur d’onde plus grande de MinDE in vitro (10 x 30 µm), doublé d’une bicouche lipidique pris en charge a permis la reconstitution des oscillations de pôle-à-l’autre MinDE et formation dégradé des protéines 10,,25. Dans cet essai, la prise en charge des bilayers de lipide sont déposés sur un substrat PDMS à motifs qui contient plusieurs centaines de répliques de microcompartments en forme de bâtonnet qui restent ouvertes sur le dessus. Par la présente, la réaction peut être mises en place dans une chambre ouverte, et par la suite la mémoire tampon est abaissé jusqu’au bord de la microcompartments, limitant ainsi la réaction d’un petit volume. Même si ces compartiments disposent d’une interface d’air-tampon sur un côté et par conséquent ne représentent pas un accouchement en 3D par membrane, la dynamique des protéines imité en vivo oscillations10,,25. Par rapport à l’accouchement entièrement en 3D, qui montre très proche des résultats18, l’essai de microstructures ouverts est relativement simple et facile à gérer et peuvent également être effectuées par des laboratoires qui ne sont pas dotés d’équipements spécialisés de la microfluidique et installations de salle blanche.

Nous présentons ici un protocole expérimental pour la reconstitution de MinCDE formation du patron sur prise en charge lipidique bicouches in vitro à l’aide d’une chambre ouverte qui permet le contrôle de tous les composants et un accès facile par microscopie optique et, avec la mineure modifications, est aussi adaptable pour des techniques de sonde de surface26. À côté des bicouches lipidiques planes de prises en charge, nous montrons aussi comment le confinement de la protéine peut être obtenue à l’aide des bicouches lipidiques pris en charge à motifs simples sur bâtonnet des microstructures PDMS. Ces tests, bien qu’optimisé pour le système de MinCDE, peuvent aussi être transférées à d’autres systèmes de protéines qui interagissent de façon similaire à la membrane, comme FtsZ27 ou un minime actine cortex28.

Protocol

1. la Production de protéines Expression de la protéine Transformer des e. coli BL21 (DE3) pLysS avec le plasmide respectif pour l’expression de l’esprit6, esprit EGFP29, mRuby3-esprit24, MinE6 ou MinC30. Cartes de plasmide, s’il vous plaît voir information supplémentaire. Ensemencer une culture d’une nuit ou plus dans le milieu LB avec une seule colonie à l’aide d’antibiotiques respectifs (par exemple,100 µg/mL d’ampicilline ou kanamycine de 50 µg/mL) et incuber à 37 ° C pendant 14 à 16 h et en agitant. Ensemencer les 500 mL de milieu de TB contenant l’antibiotique respectif avec la culture au jour le jour (dilution 1 : 200) et incuber à 37 ° C, la culture et en agitant à 180 tr/min. Induire l’expression de la protéine en ajoutant 0,5 mM IPTG lorsque la culture atteint une densité optique à 600 nm de 0,5 à 0,7. En cas de EGFP-esprit ou esprit mRuby3, décaler les cellules dans un incubateur à 16 ° C et la croissance de cellules pendant 14 à 16 h et dans le cas de MinC, esprit ou la MinE, la croissance de cellules pour 3-4 h à 37 ° C après l’induction.Remarque : Induction de MinC, esprit ou la MinE expression est toxique pour les cellules, comme résultats de surexpression dans la division cellulaire des défauts ; par conséquent, il est important que le temps d’incubation à 37 ° C est maintenue au-dessous de 4 h. Si plus de protéines est nécessaire, augmenter la quantité de culture, mais pas le temps d’incubation. Après un temps d’incubation respectifs récolter les cellules par centrifugation à 4000 x g pendant 10 min et stocker le culot cellulaire à-80 ° C jusqu’à réutiliser. Purification de protéineRemarque : Les protéines peuvent être épurées utilisant des colonnes de Ni-NTA préemballés sur un système de purification de protéine automatisée ou en utilisant des perles de Ni-NTA pour la purification de banc d’écoulement par gravité. Pour purification avec colonnes, Ni-NTA préemballés sur protéine automatisé purification systèmes utilisation tampon A1 (50 mM de phosphate de sodium pH 8,0, 500 mM NaCl, imidazole de 10 mM), tampon B1 (50 mM de phosphate de sodium pH 8,0, 500 mM NaCl, imidazole de 20 mM) et tampon C1 (sodium 50 mM phosphate pH 8,0, NaCl, imidazole de 250 mM à 500 mM). Pour la purification de banc d’écoulement par gravité à l’aide de Ni-NTA perles utilisent tampon A2 (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, imidazole de 10 mM), B2 (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, imidazole de 20 mM) de la mémoire tampon et mettre en mémoire tampon C2 (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, imidazole 250 mM). Compléter toutes les mémoires tampons avec 10 mM β-mercaptoéthanol ou 0,4 mM TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine) comme agent réducteur juste avant utilisation. Remettre les cellules en 20-30 mL de tampon A1 ou A2 additionné de Mg2 +- ADP sans EDTA inhibiteur de la protéase, 100 µg/mL lysozyme, ~ 250 U/mL DNase et 0,2 mM (Mg2 +ADP – esprit ou esprit-EGFP purification seulement, dans le cas d’un 100 mM ADP stock en 100 mM MgCl 2 dont le pH est ajusté à 7,5). Lyse des cellules en utilisant un sonicateur pointe (amplitude de 30 %, 2,5 min, impulsion de 30 s, 30 s off) tout en gardant le flacon contenant les cellules dans un bain de glace. Enlever les débris cellulaires en centrifugeant la cellule lysate pendant 45 min à 25 000 x g et 4 ° C. Incuber le surnageant sur colonne de Ni-NTA ou perles Ni-NTA. Pour les colonnes Ni-NTA préemballées, charger l’échantillon sur la colonne à l’aide de la pompe de prélèvement d’un système de purification de protéine automatisé. Pour la paillasse purification, incuber l’échantillon avec des perles de Ni-NTA dans un tube de réaction de 50 mL sur un agitateur rotatif à 4 ° C pendant 1 h. Pour les étapes ultérieures, transférer les perles Ni-NTA dans une colonne vide à l’aide d’une pipette 25 mL. Laver avec au moins 5 volumes de colonne du tampon A1 ou A2. Laver avec au moins 5 volumes de colonne du tampon B1 ou B2. Éluer les protéines avec tampon C1 ou C2. Évaluer la pureté de la protéine par SDS-PAGE. Facultatif : Purifier davantage protéine en l’appliquant à une colonne de gel filtration équilibrée dans le tampon de stockage (50 mM HEPES/KOH pH 7,2, 150 mM de KCl, 10 % de glycérol, 0,1 mM EDTA, 0,4 mM TCEP, (0,2 mM Mg2 +- ADP dans le cas d’esprit)).Remarque : Filtration sur Gel est recommandée pour l’esprit éliminer la fraction protéique agrégées. Si n’on utilise aucun gel-filtration, échange tampon d’élution Ni-NTA à tampon de stockage (50 mM HEPES/KOH pH 7,2, 150 mM de KCl, 10 % de glycérol, 0,1 mM EDTA, 0,4 mM TCEP, (0,2 mM Mg-ADP dans le cas d’esprit)) à l’aide d’une gravité flow colonne dessalement (voir Table des matières). Congélation protéines en aliquotes dans l’azote liquide et conserver à-80 ° C jusqu’à l’utilisation ultérieure. Mesurer la concentration stock de protéines à l’aide d’analyse de Bradford et déterminer l’activité de la protéine avec une ATPase dosage20.Remarque : Ne pas évaluer la concentration de protéines à l’aide d’absorption à 280 nm. La présence de nucléotides durant la purification de l’esprit et l’absence de tryptophanes dans le mien fausser une mesures de concentration de280 . Utilisation Bradford ou BCA tests pour mesurer les concentrations de protéine à la place. Marquage de protéinesRemarque : La fusion d’une protéine fluorescente à la petite protéine MinE induit des principaux changements à ses propriétés de diffusion et de la fonction ; donc, le marquage chimique de la protéine (la cystéine en position 51) est préféré à fusion de protéines fluorescentes. Dissoudre 0,125 mg de maléimide-colorant conjugué dans 5 à 10 µL de DMSO (diméthyl sulfoxyde) et ajouter sous agitation à un 0,5 mL MinE aliquote dans un tampon de stockage à un pH de 7,2, préparé comme indiqué ci-dessus. Incuber pendant 2 h à une nuit à 4 ° C ou 2 h à ta douce secouant ou en remuant. Colorant distinct et protéines à l’aide d’un écoulement par gravité dessalage colonne équilibrée avec tampon de stockage (50 mM HEPES/KOH pH 7,2, 150 mM de KCl, 10 % de glycérol, 0,1 mM EDTA, 0,4 mM TCEP). Pour plus amples supprimer n’importe quel colorant seule, dialyser la protéine contre un excès de tampon de stockage. Vérifier l’étiquetage avec succès par la mesure de l’extinction au maximum de la teinture respectif et calculer l’efficacité estimée d’étiquetage. Veuillez vous référer aux instructions du fabricant de la teinture pour un protocole détaillé sur l’estimation du degré d’étiquetage. Analyser avec SDS-PAGE et déterminer total masse par spectrométrie de masse pour plus des informations utiles sur l’homogénéité de l’échantillon et l’étiquetage des succès. 2. les petites vésicules unilamellaires (SUV) préparation Génération de vésicules multilamellaires Calculer la quantité de lipid(s) dans le chloroforme pour votre mélange désiré et le volume final de SUV. La concentration doit être de 4 mg/mL de lipides dans un tampon Min (25 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM de KCl, 5 mM MgCl2). Pour un dosage de Min standard, un mélange de 7:3 DOPC:DOPG (% de mol) est recommandé. Lors de l’extraire à l’aide d’e. coli lipides polaires, utiliser un tampon SLB (25 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM KCl) pour toutes les étapes de préparation.Remarque : Il n’est pas recommandé pour les utilisateurs d’utiliser des extraits de lipides polaires d’e. coli comme la génération de SLBs homogènes avec ce mélange est beaucoup plus difficile. À l’aide d’une pipette volumétrique avec des bouts de verre, mélanger les lipides dans le chloroforme dans un flacon en verre de 1,5 mL. Sécher les lipides sous courant d’azote léger tout en tournant lentement le flacon. Placer les lipides sous un courant d’azote plus fort pendant 10 à 20 minutes. Placer le flacon contenant le film lipidique séchés dans un dessiccateur à vide et vide pendant au moins 1 h. Réhydrater les lipides dans un tampon Min par agitation à température ambiante jusqu’à ce que le mélange soit homogène opaque.Remarque : Pour la production de petites vésicules unilamellaires de vésicules multilamellaires, lipides peuvent être extrudés soit comme décrit au point 2.2. ou aux ultrasons comme décrit au point 2.3. En général, extrusion donne une distribution de taille plus restreinte qui peut aider à la formation des bicouches lipidiques pris en charge. Préparation des SUV par extrusion Briser les agrégats lipidiques et structures multilamellaires et solubiliser autres lipides de gel-dégel pendant 7 à 10 cycles. Préparer un récipient avec de l’eau à 70° C à 99° C sur une plaque chauffante et un récipient avec de l’azote liquide. Tenir le flacon dans l’azote liquide avec des grandes pincettes jusqu’à ce que l’azote s’arrête à ébullition. Puis transférez le flacon pour l’eau chaude jusqu’à ce que la solution est complètement décongelée. Répétez ces étapes jusqu’à ce que le mélange de lipides apparaisse clairement à l’oeil, selon le mélange. Assembler une extrudeuse de lipides et rincez d’abord le système avec le tampon de Min. Extruder le mélange de lipides entre 35 et 41 fois à travers une membrane de porosité de 50 nm. Assurez-vous de finir sur un nombre impair de passes afin d’éviter des agrégats que jamais traversé la membrane. Préparation des SUV par sonication Pour mieux dissoudre les lipides dans le tampon, placer le flacon de verre contenant la solution dans un bloc chauffant, affectez à 37 ° C et vortex toutes les 20 minutes pendant 1 minute. Incuber au total pendant environ 1 h. Plongez au fond de la fiole dans un bain sonicateur (dans cet ouvrage 1,91 L, 80 W) en attachant le flacon sur un pied de fixation à la hauteur souhaitée. Définir la hauteur d’eau dans le bain sonicateur afin que la solution entourant le flacon est bien agitée par les impulsions et laisser agir le mélange de lipides pendant environ 20 minutes. Recherchez la sonication réussie en évaluant la clarté des lipides. Vus peuvent être stockés à 4 ° C pendant une semaine ou congelés à-20 ° C dans de petites parties aliquotes (~ 20 µL) et stockés pendant plusieurs semaines. Décongeler les flacons ou tubes à température ambiante et laisser agir comme décrit sous 2.2.3 ou 5.3 jusqu’à ce que la solution soit claire avant utilisant vus pour la préparation de la prise en charge des bicouches lipidiques (SLBs). Veuillez noter que la distribution de la taille étroite des vus obtenue par extrusion est perdue après congélation et suivantes de décongélation et de sonication. 3. nettoyage des lamelles de verre Remarque : Nettoyage et HYDROPHILISATION lamelles de verre est un facteur important pour les bicouches lipidiques de prise en charge homogène et fluide. Lamelles de verre peut être nettoyé à l’aide d’une solution de piranha, faite d’un ratio de 7:2 l’acide sulfurique à 50 % d’eau oxygénée (3.1), ou avec un plasma d’oxygène dans un plasma cleaner (3.2). Les deux méthodes donnent des résultats similaires. Piranha nettoyage lamelles Appliquer la solution de piranha Répartir les lamelles de verre sur un plat de Pétri de verre inversé ou toute autre surface inerte. Avec une pipette en verre, ajouter 7 gouttes d’acide sulfurique concentré (98 %) au centre de chaque lamelle.ATTENTION : l’acide sulfurique est fortement acide et corrosif. Travaillez dans une hotte et un équipement de protection uniquement. Ajouter deux gouttes d’eau oxygénée 50 % jusqu’au milieu des gouttes d’acide.ATTENTION : l’eau oxygénée est corrosif pour les yeux et la peau. Couvrir la réaction et incuber pendant au moins 45 minutes.Remarque : Le temps maximum d’attente ici n’est pas crucial pour le résultat de l’expérience et peut être étendu jusqu’à plusieurs jours. Piranha de lavage nettoyage lamelles couvre-objet. Ramasser les lamelles individuellement à l’aide de pinces à épiler et rincer à l’acide avec de l’eau ultrapure. Placer les lamelles lavées dans anti-adhésif détenteurs ou autre dispositif de transport. Rincer chaque lamelle abondamment avec de l’eau ultrapure et sécher la surface avec un gaz sous pression (azote, air seulement si non huilé). Marquer le côté propre de la lamelle avec marqueur permanent. Plasma nettoyage lamelles Rincer les lamelles couvre-objet avec excès d’éthanol et, ensuite, avec l’excès d’eau ultrapure. Lamelles sèches avec gaz sous pression. Assembler la chambre tel que décrit dans 4. Après la chambre tel que décrit dans 4 prendre les lamelles couvre-objet avec chambre ci-joint et placer dans le plasma cleaner avec de l’oxygène dans les gaz de procédé. Nettoyer les lamelles couvre-objet avec du plasma (ce pouvoir de 30 % de travail, a été utilisé 0,3 mbar pression d’oxygène pendant 1 min). Faire le ménage juste avant la formation du SLB comme décrit en 5, que l’effet HYDROPHILISANT de nettoyage plasma s’use au fil du temps.Remarque : Timing et la puissance du plasma de nettoyage doivent être optimisés à l’aide de membranes fluorescent étiquetés, comme trop peu ou nettoyage plasma excessive peut aussi bien conduire à membranes immobiles ou membranes avec trous. 4. la chambre Avec des ciseaux pointus, couper et jeter le couvercle et la partie conique d’un tube de réaction de 0,5 mL. Enduire le bord supérieur du tube UV-colle et répartir uniformément à l’aide d’un embout de la pipette. Coller le tube à l’envers à la lamelle préalablement nettoyé. Dans le cas de piranha Nettoyage Veillez à coller sur le côté nettoyé du verre. Guérir la colle UV en plaçant plusieurs chambres sous un 360 lampe nm ou LED de 5 à 15 minutes. 5. prise en charge lipidique bi-couche (SLB) Formation Préchauffer le bloc chauffant à 37 ° C et laisser incuber les tubes de réaction de 2 mL avec le tampon Min ou SLB, 1 tube par chambre. Azote de coup dans les alvéoles assemblés et soignés pour enlever toute poussière ou autres particules qui peuvent se sont installés au cours de la polymérisation par UV et de l’assemblage. Plasma nettoyage comme décrit au point 3.2 Si vous n’avez pas nettoyé vos lamelles couvre-objet avec solution de Piranha (3.1). Placez les chambres sur bloc chauffant. Diluer une aliquote de 20 µL de lipides clairs (à 4 mg/mL) avec 130 µL de tampon de Min ou tampon SLB dans le cas d’e. coli extrait de lipides polaires, ce qui donne une concentration de travail de 0,53 mg/mL. Dans le cas où les lipides ont été gelés, laisser agir tout d’abord en tenant le tube dans un sonicateur bain avant d’ajouter le tampon, puis laisser agir à nouveau avec un tampon. Ajouter 75 µL du mélange de lipides à chaque chambre et que la minuterie à 3 minutes (pour les mélanges DOPC/DOPG ; incubation plus longue peut être nécessaire pour les autres mélanges de lipides). Dans le cas d’extrait d’e. coli de lipides polaires, Pipetter CaCl2 provenant d’un stock de 100 mM dans la chambre à une concentration finale de 3 mM. Au cours de la période d’incubation, les vésicules éclatent à la surface de verre hydrophile et fusionnent pour former un SLB cohérente. Après 60 secondes, ajouter 150 µL de tampon de Min à chaque chambre. La chambre de lavage : après un autre 120 secondes (3 minutes au total) Lavez chaque chambre en ajoutant 200 µL de tampon Min ou SLB, pipetage délicatement vers le haut et vers le bas plusieurs fois, supprimant et en ajoutant un autre 200 µL. Après que chaque chambre a été lavé une fois, passez à la première chambre se laver à fond jusqu’à ce que le 2 mL de tampon sont épuisés. Lavage des SLBs a besoin de quelques expériences de perfectionner l’ampleur des mouvements dans la chambre et trouver l’intensité correcte de lavage.Remarque : Ne jamais retirer tout le liquide de la chambre pour éviter le dessèchement de la SLB.Remarque : Sur le dessus de lavage, propriétés membranaires varie en fonction de nombreux facteurs supplémentaires : Type de lipides et de leurs concentrations relatives en mélanges lipides, PROCEDE de preparation pour les SUV, traitement de surface et nettoyage préalable du support. 6. l’auto-organisation Assay Régler le volume de mémoire tampon dans la chambre à 200 µL de tampon de Min moins la quantité de protéines et de la solution de l’ATP, puis ajouter l’esprit, intitulée l’esprit, la mienne et, si vous le souhaitez, MinC. Mélanger délicatement les composants de pipetage. Exemple concentrations sont 1µm esprit (dopé avec 30 % EGFP-esprit), 1µm MinE (dopé avec 10 % chimiquement étiqueté MinE) et 0,05 µM MinC, mais patrons forment une gamme de concentrations6,10,20,30 . Ajouter 2,5 mM ATP (à partir de stock ATP 100 mM 100 mM MgCl2, pH 7.5) pour démarrer l’auto-organisation de MinDE.Remarque : L’ordre de l’ajout de composant (esprit, MinE et ATP) peut varier et n’influencera pas le modèle final résultat4. Observer l’auto-organisation MinDE sur le microscope à fluorescence (voir Table des matières). Auto-organisation MinDE peut également être observée au microscope TIRF. Pour l’imagerie eGFP-esprit, utiliser un laser à Argon 488 nm ou laser diode comparables (par exemple, 490 nm). Pour l’imagerie mRuby3-esprit, il est préférable d’utiliser un laser à diode 561 nm.Remarque : Éviter les niveaux élevés d’excitation pour nous et d’autres plus longs,17 ont observé phototoxicité dans le système de MinDE, conduisant à la polymérisation des protéines irréversible sur la membrane. 7. microstructures PDMS Remarque : Le PDMS (diméthylsiloxane) est un polymère qui peut être utilisé pour la production de microstructures et dispositifs microfluidiques. Une plaquette de silicium à motifs sert un moule pour couler les structures PDMS. Les structures PDMS puis servent comme support pour la formation de SLB et le programme d’installation de dosage. Soit produire plaquette de silicium avec microcompartments vous-même à l’aide de la photolithographie (voir Zieske et Schwille pour un protocole détaillé31 Gruenberger et coll. pour un protocole vidéo32) ou commander votre plaquette de silicium désirée d’une fonderie . Pour le modèle de la gaufrette utilisé dans les présentes, veuillez consulter des informations complémentaires. Production de microstructures PDMS de plaquettes de silicium à motifs. Un gobelet en plastique permet de peser 10 g de base PDMS et 1 g de reticulation PDMS. Soit utiliser un dispositif de mélange pour mélanger et dégazer le mélange PDMS ou mélanger manuellement le PDMS et dégazer puis sous vide. Utiliser un embout de la pipette pour déposer une petite quantité de PDMS directement sur la structure sur la plaquette de silicium.Remarque : Veillez à ne pas rayer la plaquette de silicium. Ensuite, placez un lamelle couvre-objet #1 sur la baisse PDMS et prendre l’extrémité supérieure d’un embout de la pipette propre pour appuyer légèrement sur la lamelle couvre-objet sur la plaquette de silicium. Le PDMS devrait se propager finement entre la lamelle et la plaquette de silicium. Placer la plaquette avec les lamelles dans un four et guérir le PDMS pendant 3-4 heures ou une nuit à 75 ° C. Retirer la plaquette du four et laissez-le refroidir à température ambiante. Avec une lame de rasoir, retirez soigneusement la lamelle avec le PDMS ci-joint de plaquette SI.Remarque : Pour éviter que la plaquette de silicium se sale ou endommagé, couvrez toujours les microstructures avec PDMS et un lamelle couvre-objet. Cependant, âges PDMS, résultant dans les fissures des microstructures, donc ne pas utilisent structures PDMS antérieurs à deux ou trois semaines. 8. self-organization en Microstructures PDMS Utilisation de lamelles avec microstructures PDMS pour attacher une chambre comme décrit moins de 4 ans. Nettoyez et hydrophilize surface dans un plasma oxygène nettoyant comme décrit sous 3.2.2. Ne pas piranha PDMS substrats propres. Configurer un test d’auto-organisation MinDE comme décrit moins de 6 ans. Après avoir configuré le test, vérifier pour la formation régulière du patron MinDE et microstructures correctement formés sur le microscope à fluorescence. Lorsque les patrons de MinDE réguliers ont formé (10-30 min), Pipetez doucement de haut en bas pour mélanger les composants et puis retirez le tampon étape par étape de pipetage. Enlever le gros gros de tampon à l’aide d’une pipette µL 100 et puis retirer délicatement le reste à l’aide d’une pipette de 10 µL.Remarque : Cette étape devrez peut-être peu de pratique. Si trop tampon est souscrite ou le processus prend trop de temps, les microstructures vont être desséchées ; Si trop peu de choses est pris, les protéines ne se limitera pas à des microstructures, mais continuent à faire voyager des ondes de surface. Fermez immédiatement la chambre avec un couvercle pour éviter l’assèchement du tampon résiduel dans les microstructures. Pour permettre d’imagerie plus longs, branchez un humecté d’éponge à l’intérieur de la chambre et puis fermez avec le couvercle. Veillez à ce que l’éponge ne contacte pas la surface de la lamelle. Avant l’imagerie de la vérification de microstructures sur la surface que la mémoire tampon a été abaissé suffisamment, alors que dans la surface au-dessus de la formation du patron microstructures MinDE a cessée. Image : MinDE oscillations de microstructures. Vérifiez que les microstructures ne sont pas desséchées ou sont au sec pendant la formation image.Remarque : Jeter les lamelles couvre-objet avec microcompartments après chaque utilisation, comme les fissures sous la forme PDMS. 9. l’analyse de la formation MinDE Mesurer la longueur d’onde, la vitesse des ondes et profils de la vague de l’auto-organisation MinDE sur des bicouches lipidiques planes de prises en charge. Fidji à la norme établie de plugins emballés est suffisante pour l’analyse de base33. Analyser les oscillations de pôle-à-l’autre dans microcompartments en obtenant des kymographs et des profils de concentration protéique moyennée dans le temps. Kymographs de base peuvent être obtenues par re-tranchage de une série chronologique le long d’une sélection de ligne à Fidji.

Representative Results

Purification des protéines selon notre protocole devrait produire une Min protéines de pureté adéquate. Comme référence, Figure 1 offre une image de SDS-PAGE d’esprit, fluorescent étiquetés esprit MinE et MinC. Les différentes étapes de la procédure pour effectuer un test d’auto-organisation MinDE sur bicouches lipidiques supportés non texturés sont décrits à la Figure 2. Utilisant ce protocole, MinDE régulier voyageant à ondes de surface peut être observé tout au long de la chambre (Figure 3). La longueur d’onde peut varier légèrement dans la chambre, mais en général les modèles ressemblent. Les bords de la chambre ne devraient pas servir à des comparaisons quantitatives, comme membranes que forme sur la colle UV semble avoir des propriétés différentes sur le verre de surface (voir Figure 3). Les ondes de surface de voyages peuvent être analysés en traçant l’intensité le long de la direction de propagation (Figure 3 b). Alors que l’esprit de fluorescence des plateaux assez rapide de la fine pointe de la vague et donc fortement diminue sur le bord de fuite, fluorescence MinE augmente presque linéairement depuis le début de la vague d’esprit et atteint son maximum au bout d’esprit sur le bord de fuite, où il se détache nettement6. En regard de la qualité des protéines, la qualité de la prise en charge des bilayers de lipide est plus critique pour une auto-organisation régulière de MinCDE. D’une part si la membrane est lavée trop excessifs ou la surface sous-jacente a été nettoyée et donc facturée trop fortement, trous peuvent se former dans la membrane (Figure 6 a, top). En revanche si la membrane n’est pas lavée correctement ou la surface sous-jacente n’est pas nettoyé/hydrophilisée, vésicules seront en tiendra à la membrane ou la fluidité de la membrane sera compromise (Figure 6 a, en bas). Bien que pas aussi apparent que lors de l’observation de la membrane directement par l’intermédiaire de lipides marqués, ces problèmes peuvent également être détectés depuis le signal de fluorescence d’esprit, car les patrons ne sont pas réguliers et la fluorescence dans les maxima n’est pas homogène, mais contient des « trous » ou points lumineux comme indiqué dans le panneau central de la Figure 6 a. Pour l’auto-organisation MinDE en bâtonnet des microstructures PDMS, la procédure est résumée dans la Figure 4. Plusieurs étapes de protocole n’avez pas besoin d’être répété, comme les protéines et les lipides peuvent être réutilisés. Comme si sur des substrats non texturés, le substrat est nettoyé et HYDROPHILISÉ (par plasma-nettoyage), une prise en charge double couche lipidique est formé sur le PDMS et le dosage de l’auto-organisation est mis en place dans un volume de 200 µL. Pour vérifier qu’une membrane appropriée a formé et MinDE s’organise sur la membrane, les chambres sont imagés. Lorsqu’une membrane appropriée a été formée, MinDE formes régulières voyageant ondes de surface sur la surface des PDMS entre les microstructures individuelles et aussi s’organise au fond des microstructures comme les vagues peuvent librement se déplacer sur toute la surface de membrane recouverte (Figure 5 a). Après le retrait du tampon, la surface entre les compartiments ne doit pas afficher n’importe quel modèle de MinDE multiplication (Figure 5 b), comme cela doit être entièrement sec. Si MinDE modèles circulent encore, plus de mémoire tampon doit être retiré. Les protéines sont maintenant confinés dans le microcompartments en forme de tige par le PDMS revêtu de membrane et par voie aérienne sur l’interface supérieure (Figure 5), dans laquelle ils vont s’auto-organiser. Dans ces conditions les deux protéines peuvent effectuer des oscillations de pôle à pôle comme illustré à la Figure 5. Comme une fraction de l’esprit et le mien est toujours liée à la membrane, également au moment du retrait du tampon, les concentrations après le retrait du tampon ne sont pas comparables à des concentrations d’entrée. En raison de cet effet les concentrations varient également entre les microstructures individuelles sur la lamelle couvre-objet même car elles dépendent de la position des modèles avant l’enlèvement de la mémoire tampon. Production de wafer de silicium ou une moulure de PDMS de la plaquette de silicium peut entraîner des microstructures incomplètes qui ne peut pas être utilisés pour l’analyse (Figure 6 b). En outre, en raison de la mémoire tampon microstructures d’enlèvement peuvent dessécher pendant le processus et devraient donc être exclus de l’analyse (Figure 6 b). Ainsi qu’une fraction des microstructures dans une chambre montre les oscillations de pôle à pôle désirées. Pour analyser la dynamique des protéines dans les microstructures, un kymographes peut être obtenue en traçant une sélection sur l’ensemble de la structure (Figure 5E). Lorsque MinCDE oscillent de pôle à pôle, MinC et esprit montrera un gradient de concentration moyenne temporelle avec une concentration maximale au niveau des pôles de compartiment et la concentration minimale au milieu du compartiment (Figure 5F). Figure 1 : SDS-PAGE, montrant les produits finaux de purification de protéine. Son esprit (33,3 kDa), His-eGFP-MinD (60.1 kDa), His-mRuby3-esprit (59,9 kDa), His-MinE (13,9 kDa) et His-MinC (28,3 kDa) sont affichés dans l’ordre. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : diagramme de flux de processus montrant les différentes étapes et le calendrier du protocole d’une auto-organisation sur bicouches aux motifs non pris en charge lipidique (étapes 1 à 6). Boîtes en pointillés indiquent qu’un de ces deux options peut être utilisé pour le nettoyage. Les flèches marquées par des cercles indiquent où le protocole peut être suspendu et repris plus tard. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : imagerie du MinDE dosage par microscopie confocale. A) spirale régulière Min, partir quel vitesse de propagation des ondes, la parcelle de l’intensité et la vitesse des mesures peuvent être obtenues. Concentrations utilisées : 0,6 µM (30 % eGFP-esprit) de l’esprit, 1,8 µM His-MinE (30 % His-MinE-Alexa647) B) intrigue intensité normalisée exemple pour la région marquée a. C) vue d’ensemble de chambre de dosage complet (Echelle : 1 mm, les mêmes concentrations de protéine que Voir ci-dessus). Spirales ou l’autre sens de rotation ainsi que les évolutions de la cible peuvent être observées. La région agrandie montre comment les modèles de vagues diffèrent sur la colle UV. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : diagramme de flux de processus montrant les différentes étapes et le calendrier du protocole d’auto-organisation en bâtonnet microstructures (étapes 1 à 5, 7, 8). Cases grises indiquent pas où les produits peuvent être réutilisés de protocole sur des bicouches lipidiques supportés non texturés. Les flèches marquées par des cercles indiquent où le protocole peut être suspendu et repris plus tard. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 5 : résultats représentatifs pour MinDE modèle formation en bâtonnet PDMS microcompartments. A) MinDE s’organiser sur la surface de la PDMS faisant voyager des ondes de surface (l’esprit de 1 µM (30 % EGFP-esprit), 2 µM MinE et ATP 2,5 mM). B) après que la mémoire tampon est abaissé à la hauteur des microstructures, l’auto-organisation de la protéine s’arrête sur la surface plane entre les microcompartments. C) schématique d’un microcompartiment en forme de bâtonnet. D) des images représentatives des oscillations de pôle-à-l’autre MinDE après le retrait de la mémoire tampon. E) kymographes des oscillations le long de la ligne en surbrillance montré D). F) Image et profil de l’intensité de fluorescence moyenne de la série chronologique montrée D) montrant clairement le gradient de protéine qui est maximale aux pôles de microcompartiment et un minimum au milieu du compartiment. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 6 : exemples de résultats expérimentaux négatifs. A) membranes trop lavés accumulent des trous, alors que préparations de vésicule sous-optimal et compositions lipidiques conduisent à coller des vésicules. Les panneaux de deux Centre montrent une combinaison de problèmes et comment ils deviennent visibles lors de l’observation des oscillations de Min. Les membranes ont été marquées avec 0.05 % Atto655-DOPE. (barreaux de l’échelle : 50 µm) B) panneau supérieur : dessèchement microcompartments peut être causée par trop d’enlèvement de tampon ou lorsque la mémoire tampon s’évapore au fil du temps. Panneau inférieur : compartiments incomplètes peuvent être formés au cours de la production de wafer ou le moulage de PDMS. (échelle bars : 30 µm) S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Fichier supplémentaire 1 : Carte plasmidique pour son esprit. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier. Fichier supplémentaire 2 : Carte plasmidique pour son EGFP-esprit. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier. Fichier supplémentaire 3 : Carte plasmidique pour son mRuby3-esprit. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier. Fichier supplémentaire 4 : Carte plasmidique pour sa MinE. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier. Fichier supplémentaire 5 : Carte plasmidique pour His-MinC. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier. Complémentaire fichier 6 : Fichier de CAO pour la plaquette de silicium de microcompartments en forme de bâtonnet. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Nous avons décrit un protocole pour la reconstitution in vitro de l’auto-organisation MinCDE sur planaire étayée des bicouches lipidiques et en lipides bicouche couvert de structures 3D, en utilisant l’exemple des microstructures PDMS en forme de bâtonnet. Afin d’obtenir des données précieuses de ces essais, les facteurs les plus importants de contrôle sont qualité de protéine et de la membrane.

Pour assurer la qualité des protéines, protéines masse doit être confirmée par SDS-PAGE et spectrométrie de masse. En outre, il convient de vérifier que les protéines sont solubles et non agrégées, en utilisant la filtration sur gel analytique ou diffusion dynamique de la lumière. Filtration sur gel peut être utilisée pour supprimer toute fraction agrégée des protéines. Ajustement du pH attention et la qualité des nucléotides supplémentaires est critique, comme l’addition de nucléotides non ajustées ou partiellement dégradés à la protéine stocks ou self-organizing dosages est suffisant pour éliminer l’activité de la protéine, donc abolir self-organization.

En regard de la qualité des protéines, qualité de la membrane est plus critique, et formation inadéquate de membrane est le plus souvent la cause de l’auto-organisation défectueuse et l’origine des structures de surface artéfactuelles.

Lors de l’exécution du protocole pour la première fois, il est utile de numéroter les bicouches lipidiques pris en charge en incluant des lipides marqués comme Atto-655-DOPE ou DiI à faibles pourcentages molaires (0,05 %). Ainsi les propriétés et la qualité de la membrane peuvent être jugées directement. À l’aide de FRAP, la fluidité de la membrane peut être évaluée. En outre, on peut évaluer directement la qualité du lavage de la SLB, car il y aura soit être trop de vésicules, aucune membrane liquide ou aucune membrane du tout, si il a été lavé. L’approche de la chambre ouverte permet de laver rigoureusement la membrane et donc aussi pour enlever les vésicules qui sont en tiennent à la surface de la SLB. Les facteurs cruciaux pour l’obtention de fluide et homogène de prise en charge lipidique bicouches sont le nettoyage et la hydrophilicité de la surface d’appui et de la bonne taille et l’homogénéité de la SUvs , il peut être utile vérifier la taille SUV et taille à l’aide de la distribution diffusion dynamique de la lumière. Pour les distributions de taille étroite, nous recommandons les vésicules d’extrusion, plutôt que de sonification eux. Autres méthodes de nettoyage lamelles couvre-objet, par exemple, les traitements avec des bases fortes, détergents de base ou à l’aide de lamelles directement après le rinçage avec de l’eau, peuvent donner de bons résultats, selon le mélange d’application et de lipides.

La première moitié du protocole présenté ici, reconstitution de in vitro sur des bicouches lipidiques planes de prises en charge dans des chambres ouvertes, a l’avantage de rendre la surface accessible pour la microscopie optique, tels que TIRF microscopie30, PAF analyse6, particule suivi34, ainsi que des techniques de sonde de surface telles que la microscopie de force atomique26. La grande surface homogène permettant de meilleures statistiques à des concentrations déterminées. En outre, l’approche de chambre ouverte permet de contrôler précisément la concentration de protéines et un ajout rapid et simple des autres composants, donc permettant d’ajuster la concentration de protéines dans une seule chambre20. Le test peut aussi être étendu par l’addition d’autres composants de divisome bactérien FtsZ22,35, ZipA22 ou la protéine chimère FtsZ-YFP-MTS10,35.

Autres groupes ont adopté une approche similaire pour reconstituer le Min système in vitro, mais d’utiliser une cellule de flux au lieu d’une chambre ouverte17,18,19. Flux-cellules ont certains avantages, en particulier lorsqu’un environnement 3D entièrement clos est nécessaire18, l’influence du débit de19,17,23 ou membrane composition23 sur les habitudes de MinCDE objet d’une enquête, ou si les profils protéiques doivent être observées sous protéines limitant les conditions19. Néanmoins, le contrôle local des concentrations moléculaires est plus difficile. Composants de protéines, en particulier l’esprit, est fortement lient à la membrane qu’ils rencontrent d’abord18,19. Dans notre expérience, les protéines présentent souvent non-spécifiques à tubes, de criques, de seringues et d’autres parties de la microfluidique. Par conséquent, des concentrations de protéines locales diffèrent des concentrations d’entrée18 et également varient sur la longueur de la cellule d’écoulement, résultant en une variété de modèles de différentes protéines sur la membrane entre entrée et sortie, tel qu’observé par d’autres19.

La seconde moitié du protocole présenté ici, la reconstitution in vitro en microstructures en forme de bâtonnet, ré-utilisation de l’approche de la chambre ouverte sur un support à motifs couvert par les lipides bicouches permet un simple imitateur de comportement de protéine en vivo même si un contrôle précis sur les concentrations de protéine est perdu en raison de la suppression de la mémoire tampon. Notez que parce que la longueur d’onde de MinDE est environ un ordre de grandeur plus grande in vitro que in vivo les microcompartments en forme de tige sont également environ un ordre de grandeur plus grande (10 x 30 µm) qu’un bâtonnet d’e. coli cellulaire.

Dans l’ensemble, ce protocole permet un contrôle précis de toutes les conditions, y compris la concentration protéique, la composition du tampon et propriétés de la membrane. L’utilisation de supports structurés 3D permet la réaction d’être étudié sous confinement spatial, imitant en vivo comportement sans le besoin d’équipement complexe microfluidique.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Michael Heymann et Frank Siedler pour la production de silicium gaufrettes, Core Facility MPI-B pour l’assistance dans la purification de la protéine et Simon Kretschmer et Leon Harrington pour commentaires sur le manuscrit.

Materials

Reagents
DOPC Avanti Polar Lipids 850375
DOPG Avanti Polar Lipids 840475
E.coli polar lipid extract Avanti Polar Lipids 100600
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt trihydrate Roche
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate Sigma A5285-1G
Sodium chloride VWR 27810.295
Potassium chloride Roth 6781.1
Tris-base Sigma Aldrich T1503-1kg
Hydrochloric acid Roth 9277.1
TCEP-HCl Termo Fisher Scientific 20491
Ethylene Diamine Tetraacetate Merck Millipore 1.08418.1000
Sulfuric Acid 98% Applichem 173163.1611
Hydrogen Peroxide 50% Applichem 147064.1211
HEPES Biomol 05288.1
dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck 102950 Uvasol
Glycerol 86% Roth 4043.1
TB medium
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Roth 2316.x
Atto-655-DOPE Atto Tec AD 655-161
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
PDMS base Dow Corning Corporation SYLGARD 184
PDMS crosslinker Dow Corning Corporation
Materials
UV Glue Norland Products 6801 #68 and #63 both work well
Coverslips #1.5 24×24 mm Menzel Gläser
Coverslips #1 24×24 mm Menzel Gläser used only for PDMS microstructures
0.5 ml reaction tube Eppendorf  0030123301
culture flask 2L Corning e.g. 734-1905
His-Trap HP GE Healthcare Life Sciences
Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG GE Healthcare Life Sciences
Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column Biorad 7322010
dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 – 0.5 mL or 0.5-3 mL Termo Fisher Scientific 66333 or 66330
razor blade
Instruments
ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems Merck
automated protein purification system: Äkta Pure GE Healthcare Life Sciences
bath sonicator Branson e.g. Model 1510
ARE-250 mixer Thinky Corporation
Plasma cleaner Zepto Diener electronic use oxygen as process gas
positive displacement pipettes Brand Transferpettor models with glass tips
LSM780 confocal laser scanning microscope Zeiss Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective
Plasmids
pET28a-His-MinD_MinE Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield
pET28a-His-MinE Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-MinE
pET28a-His-EGFP-MinD Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-EGFP-MinD
pET28a-His-mRuby3-MinD Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-mRuby3-MinD
pET28a-His- MinC Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille plasmid encoding His-MinC
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References

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Ramm, B., Glock, P., Schwille, P. In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers. J. Vis. Exp. (137), e58139, doi:10.3791/58139 (2018).
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