人間でタグ内因性のタンパク質誘導多能性幹細胞 CRISPR/Cas9 を使用して

1インシリコの設計と crRNA ドナー テンプレート プラスミド FP ノックインの。 NCBI16から注釈参照シーケンスまたは UCSC のゲノムのブラウザー17 (例えば、 GenBank フォーマット) の興味の遺伝子を取得し、好みのバイオインフォマティクス ソフトウェアにインポートします。基準変種を含むホストのゲノムの塩基配列が既知の場合はバイオインフォマティクス ソフトウェアのリファレンス ・ シーケンスを調整することによって今、(議論を参照)。 目的の FP 挿入部位を探します。C 末端タグの最後の基本クラスの最後のコドンと終止コドンの一塁間 FP タグのシーケンスが導入されます。N 末端タグ、FP タグのシーケンスは開始コドンの最後と次のコドンの塁間通常導入されます。開始コドンが 1 つのコドン エクソンやシグナル配列がタンパク質の末端に近い存在するなど、いくつかのケース必要な FP の挿入部位は、それはフレームを続けている限り、詳細 3ʹ 位置に位置して可能性があります。 公開されている crRNA デザイン ツールの入力シーケンスとして必要な挿入部位の両側に使用 50 bp。2 4 crRNA ターゲットを挿入部位近く識別、一度 crRNA 結合部位とバイオインフォマティクス ソフトウェアの protospacer 隣接するモチーフ (PAM) シーケンス (NGG) に注釈を付けます。これらの crRNAs は、二重鎖改 (crRNA デザインについての説明を参照) を誘導するために使用されます。注: カスタム crRNA シーケンスを合成 (推奨)、商業ベンダーに送信できるまたはこのプロトコルの範囲を超えている合成戦略、クローン作成または体外の設計シーケンスを開始点として使用できます (ディスカッションを参照してください。). (これは N ターミナル挿入の開始コドンを含める必要があります) 5ʹ 相同性の腕として必要な挿入部位の上流のシーケンスの 1 kb を使用し、3ʹ として必要な挿入部位の下流のシーケンスの 1 kb を使用、ドナー テンプレート プラスミドを開始するにはホモロジーの腕 (これは C ターミナル挿入の停止コドンを含める必要があります)。2 つの相同性の腕の間の拠点は通常省略されていません。相同性の腕の中で細胞特定のバリアントを含む結果の編集されたセルのこれらの遺伝的変異が保持されます。 2 つの相同性腕の間挿入 FP (または他のノックのシーケンス) の順序とリンカー順序 (リンカーについての説明を参照)。N 末端タグ リンカー シーケンスする必要があります直接 fp; 3ʹC 末端のタグ、リンカー順序は FP の 5ʹ 直接する必要があります。 Cas9 ドナー シーケンスの切断を防ぐためにドナー テンプレート プラスミド crRNA 結合部位を混乱させる (crRNA 結合部位を変更するときの考慮事項の説明を参照)。可能であれば、NGG またはおいぼれ馬以外のシーケンスに PAM の中断お勧めします。CrRNA (PAM に近位 10 拠点) の種子地域の 3 拠点に点突然変異を導入することを予測して十分に crRNA の結合を妨害する代わりに、いくつかの crRNA 結合部位がドナー テンプレート プラスミド; で FP シーケンスの導入によって破壊されPAM、またはそのまま結合領域まだが存在しないことでこれらのケースを確認します。注: は、ドナー テンプレート プラスミドインシリコ商業ベンダーによって遺伝子合成のため送信されるか、それはこのプロトコルの範囲を超えているクローン作成戦略を設計する出発点として使用できます。PUC19 など pUC57 単純なバックボーンで十分です。 2. リボ核タンパク質 (RNP) トランスフェクションに CRISPR/Cas9 を介したノック – hiPSCs の 注: このプロトコルでは ‘gRNA’ という用語について説明します合成 crRNA と tracrRNA 正しく再懸濁、未知数、製造元の指示に従って前複合体 (材料の表を参照してください)。1% のすべてのメディアを補うペニシリン ストレプトマイシン。WTC による線の培養の一般的なガイドラインは、アレン セル エクスプ ローラー18,19詳細で説明されます。WTC hiPSCs は、このプロトコルでは、適切なトランスフェクション最適化、RNP のエレクトロポレーションを使用され、ドナー テンプレート プラスミドは他のセルタイプに正常に適応させること。 GRNA と野生型s. 化膿Cas9 蛋白質2,20; の株式を働いている 10 の μ M を準備します。氷の上を保ちます。1 μ g/μ L のドナー テンプレート プラスミド; 通常在庫を準備します。室温 (RT) で維持します。すべて希釈液の pH 8.0 TE バッファーを使用します。 5 ml の新鮮な成長培地 10 μ M ROCK 阻害剤 (Ri) ウェルあたりのマトリックス コート 6 ウェル培養プレートを準備します。おいてメディアでプレート インキュベーター 37 ° C、5% CO2で準備ができるまでプレート細胞にトランスフェクション手順 (最大 2 時間) の後。注: このプロトコルで使われるすべてのマトリックス コーティング プレートは冷たいマトリゲル量希釈 1:30 のアレンの協会によると冷たい DMEM/F12 メディアで細胞科学のプロトコルの WTC によるライン19を培養するためを追加することによって行われます。 材料の表で推奨されるように穏やかな単一細胞解離試薬を使用して、自動化された細胞カウンター、または検定を使用して単一細胞懸濁液および count セルに hiPSCs を通路します。注: ここで使用される WTC によるラインのための詳しいプロトコルは、アレン セル エクスプ ローラー19見つけることが。簡単に、RT DPBS 一度セルを洗浄し、3-5 分間解離試薬とを扱います。その後、カップ刻んだセル単一細胞懸濁液に穏やかなピペッティングしてペレット遠心分離によって。成長培地 10 μ M Ri の生細胞ペレットを再懸濁します。 1.84 x 10 の因数別 1.5 mL チューブにトランスフェクションするのに実験条件ごとに6セルを準備します。注: すべてのボリュームは、2.3 反応時間の 100 μ L エレクトロポレーション ボリュームで 4.5 μ L 全反応量について計算されます。このアカウントは、重複したトランスフェクションとピペッティング エラーの過剰。 2.88 μ 10 μ M gRNA と 10 μ M の 2.88 μ L を追加することによって各実験条件のリボ核タンパク質 (RNP) 複雑なチューブを準備 1.5 mL チューブに Cas9。最低 10 分 (最大 1 時間) 室温で孵化させなさい。 1 つのセル分注 (2.3.1 の手順で準備) 3 分吸引した上清の 211 x g でペレットし、製造元のエレクトロポレーション バッファーの 220 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。 2.4 準備した 1.5 mL RNP 複合管に 2.5 ステップから再懸濁細胞の 220 μ L を追加します。 2.4 準備した 1.5 mL チューブに 1 μ g/μ L ドナー テンプレート プラスミドの 4.60 μ L を追加します。 Nucleofection チップ、ピペットを使用して、2 〜 3 回、チューブ内をミックスし、懸濁液 100 μ L を準備されたエレクトロポレーションのデバイスに転送します。ヒント任意の気泡を導入することは避けてください。1300 V 30 ms の 1 パルスを適用します。 ゆっくり旋回運動と 2.2 の段階から準備 6 ウェル プレートに懸濁液を転送します。軽くサイド ・ ツー ・ サイドとフロント-バック プレートを移動することによって細胞を分散させます。 新しい nucleofection チップを使用して、懸濁液および伝達の残りの 100 μ L で準備 6 ウェル プレートの 2 つ目のウェルに、2.8 2.9 手順を繰り返します。 GRNA と組み合わせごとにドナー テンプレート プラスミド、非ターゲット gRNA、ドナー テンプレート プラスミドのみ、バッファーだけコントロールなど 2.4 2.10 ~ の手順を繰り返します。クロス汚染を避けるためピペットと nucleofection のヒントを変更する注意してください。 37 ° C、5% CO2で transfected セルを孵化させなさい。メディアを 24 h で、通常成長媒体 (Ri なし) に変更し、72 96 h、密度の監視のすべての 24 h hiPSCs を送り続けます。HiPSCs、60-80% の合流点に到達するときは、手順 3 に進みます。注: 重い細胞死 (> 70%、推定) はトランスフェクション後、通常 24 ~ 48 時間。 3. 推定編集 hiPSCs FACS 濃縮 注: 幹細胞をソートするには、議論で提案した細胞の生存を促進するための機器の設定を適応します。簡潔に、使用最大ノズル可能 (130 μ m)、低流量 (≤ 24 μ L/分)、防腐剤フリー シース液 (生理食塩水など材料の表を参照)、低いサンプル圧 (10 psi)。 FACS 実験を開始する前にメディアを成長培地 10 μ M Ri に変更し、FACS 後の生存を促進するために 2-4 h の CO2を 37 ° C、5% でセルを孵化させなさい。 材料の表で推奨されている穏やかな単一細胞解離試薬を使用して、単一細胞懸濁液 10 μ M Ri19を添加した成長媒体に hiPSCs を通路します。 ポリスチレンの丸底チューブに 35 μ m のメッシュ フィルターを通過による懸濁液をフィルタ リングします。 破片やダブレットを除外する前方散乱、側方散乱 (幅と高さを含む) を使用してセルを並べ替えます。ライブを使用、バッファーのみコントロール FP 肯定的なゲートを設定するセル、< セルだけをバッファーの 0.1% 落ちるゲート内。 並べ替え FP 陽性の全体の人口は 0.5-2 を含む 1.5 15 mL ポリプロピレン チューブに細胞 RT 成長培地 10 μ M Ri の mL。注: ポリプロピレン プラスチックに細胞接着の可能性を低減します。 室温 3 分 211 x g で収集した細胞を遠心分離します。 慎重に上清を吸引し、10 μ M Ri を添加した成長媒体の 200 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。新鮮なマトリックス コーティング 96 ウェル プレート19の単一の井戸に最大 3,000 並べ替えセルを転送します。注: 適切な機器設定とセル並べ替えることもできます (一括) で 10 μ m Ri ウェルあたり 1,000-3,000 の推奨密度で補われる成長媒体の 200 μ L を含むマトリックス コーティング 96 ウェル培養プレートの単一の井戸に直接こと。 37 ° C、5% CO2で並べ替えられた細胞を孵化させなさい。24 h で 5 μ M Ri を添加した成長媒体に、メディアを変更します。48 h で餌の細胞の通常成長媒体 (Ri なし) 72 96 h、密度の監視のすべての 24 h を開始します。FACS は 500 セルの最小値は 96 ウェル プレートのウェル 1 個で播かれる場合 50% を超えると推定される後の生存。 とき hiPSCs は 60-80% の合流点に達するし、6 ウェル プレートに成熟した形態 (滑らかな、十分に詰めてコロニー センター)、24 ウェル プレートなど、24 ウェル プレートから大きな形式プレートに通路を表示します。 6 ウェル プレートで hiPSCs 60-80% の合流点に達するし、成熟を示すときは、形態が 100 mm プレートに展開し、再イメージング プレート、凍結、またはクローン ピッキング密度 (ステップ 4)19種します。 4. 推定を生成する編集による系統 材料の表で推奨されるように穏やかな単一細胞解離試薬を使用して、単一細胞懸濁液に hiPSCs を通過し、mL19あたりのセル数を決定します。 シード 10,000 細胞成長培地 10 μ M Ri19を使用して新鮮なマトリックス コート 100 mm 細胞培養用ディッシュ上に hiPSCs の編集の人口の。播種後 Ri 24 h なし成長媒体にメディアを変更し、5-7 日間新鮮な成長媒体ごとの 24 h で hiPSCs をフィードします。 HiPSCs 巨視的表示されるコロニーを形成しているとき (約 500 μ m) 彼らが分離するのに十分な大きさです。過剰なマトリックス ・成長培地 10 μ M Ri よく19あたりの 100 μ L を追加するマトリックス コーティング 96 ウェル プレートを準備します。 解剖顕微鏡使用、P-200 ピペットまたは同様に、軽くこすり、プレート面から個々 のコロニーを吸引します。転送量 (20 〜 100 μ L) 4.3 準備した 96 ウェル プレートの単一の井戸への植民地を含みます。 すべてのコロニーが転送された後は、37˚C と 5% CO2で組織文化のインキュベーターでプレートを孵化させなさい。メディアを 24 h で、通常成長媒体 (Ri なし) に変更し、コロニー サイズ (約 1500 μ m) の約 3 倍まで 72 96 h のすべての 24 h 細胞を送り続けます。注: お勧め、トランスフェクションに使用 crRNA あたり 24 96 コロニーを拾います。孤立したクローンの生存率は通常 95% よりも大きいです。 穏やかな単一細胞解離試薬材料の表で推奨されている、通路による複製を使用新しいマトリックス コーティング 96 ウェル プレートにとおり19。 8 ch の吸引器を使用して、削除し、96 ウェル プレートの最初の列からメディアを破棄します。 P-200 マルチ チャンネル ピペットを使用して、セルを洗浄する 96 ウェル プレートの最初の列に DPBS 〜 200 μ L を追加します。8 ch の吸引器を使用して、削除し、96 ウェル プレートの最初の列から DPBS 洗浄を破棄します。 P-200 マルチ チャンネル ピペットを使用すると、96 ウェル プレートの最初の列に解離試薬の 40 μ L を追加します。 必ずヒントを変更するない交差汚染井戸 96 ウェル プレートの 6 列の合計で最大の手順 4.5.1-4.5.3 を繰り返します。解離試薬 (ステップ 4.5.3) の最初の列に追加した時刻から 3-5 分の 37 ° C の定温器にプレートを配置します。注: お勧めだけ通路に最大 6 列 (48 ウェル) 次の手順の実行に要する時間のために。最初の時間のため、このプロトコルを実行するときのみ、一度に 1 つまたは 2 つの列を通過し始めます。一度に継代の列数の制限により hiPSCs に有害であることをあまりにも長い間、解離試薬で細胞が残っていないことになります。 プレートの最初の列内のセルは、プレートの下から持ち上げて始めている場合、は、96 ウェル プレートの最初の列の DPBS 160 μ L を追加し、「12:00」でセルをそっとカップ刻んだ P-200 マルチ チャンネル ピペットを使用、「3:00」、「6:00」、および「9:00」各ウェルの位置。V 底 96年ウェル プレートに細胞懸濁液 (200 μ L) のボリューム全体を転送します。 それらの解離試薬をいるセルの残りの列に対して、手順 4.5.5ない交差汚染井戸に関してヒントを変更します。 ルート 3 分の 385 × g で遠心分離で V 底板をスピンします。 P-200 マルチ チャンネル ピペットを使用して、そっと上澄みを除去し、200 μ L、新鮮な成長培地 10 μ M Ri ウェルあたりの細胞を再懸濁します。クロス汚染しないようヒントを変更するすべての井戸に繰り返します。 新鮮なマトリックス コーティング 96 ウェル プレート19に細胞懸濁液のすべてを転送します。37 ° C、5% CO2で組織文化のインキュベーターでプレートを孵化させなさい。メディアを 24 h で、通常成長媒体 (Ri なし) に変更し、クローンの大半は 60-80% 合流まで 72 96 h のすべての 24 h 細胞を送り続けます。注: この一節細胞を普及し、96 ウェル プレートの全体の面積をより多くの成長を可能にすることができます。 クローンを監視し、それぞれ個々 のクローン ・ 96 ウェル プレートでの適切な分割比を特定 (例えば、 1:10、または 1:8)。通路による材料の表で推奨されている穏やかな単一細胞解離試薬を使用して、新しいマトリックス コーティング 96 ウェル プレートに (手順 4.5.1-4.5.8) 各クローンに適した細胞懸濁液の比を転送するクローンを作成します。37˚C と 5% CO2で組織文化のインキュベーターでプレートを孵化させなさい。メディアを 24 h で、通常成長媒体 (Ri なし) に変更し、72 96 h のすべての 24 h までクローンの大半は 60-80% の合流点に達するし、成熟形態を示す細胞を送り続けます。注: 各クローンがあります異なる分割比わずかに異なる成長率や前の通路からの生存のために凍結のステップに各クローンの井戸あたりのセル数を正規化することができますこの一節。生存と成長のさまざまなレートの変動によりいくつかのクローンは一面にはえ、これらの手順を通過中に成長に失敗します。 ルート削除清 3 分の 385 x g で V 下 96年ウェル プレートで残りの細胞懸濁液と gDNA 分離遠心細胞のペレットを保存し gDNA 分離 96 ウェル キットを使用してに進むか小球形にされた細胞 – 木までの 20˚C のプレートは保管ee 週間。 5. 96 ウェル プレート形式のクローン細胞の凍結保存 単一細胞解離試薬を使用して、ことクローン前述 (手順 4.5.1-4.5.7) の通路します。P-200 マルチ チャンネル ピペットを使用して上清を吸引し、再成長培地 10 μ M Ri の 60 μ L で中断します。すべての井戸に繰り返しますクロス汚染しないようヒントを変更します。 細胞懸濁液の 30 μ L を非行列コーティング 96 ウェル培養プレートに転送します。170 をすばやく追加バッファーを凍結 μ L (材料の表を参照) を混合せず、各ウェル。妹に懸濁液の残りの 30 μ L を転送することによって繰り返しプレートと凍結 170 μ L の追加のバッファーです。注: このプロセスで行われます重複姉妹板、個々 のプレートの一つを解凍後にセルのバックアップ人口が存在します。速く融解 (ステップ 5.6) 96 ウェル プレートのだけすべての他の列に凍結保存した細胞を置くことができます。 板パラフィルムをラップし、RT 発泡スチロール ボックスのふたに置きます。-80 ° C のフリーザーで全体のボックスを配置します。 24 h 後板を発泡スチロールの箱から転送し、- 80 ° c で最長 4 週間保存できます。注: セルは-80 ° C で一時的に格納されている、遺伝的品質管理試金実行できます 4.6.1 の手順で解凍し、さらに、前述した以前に公開された作品を伝達するクローンを識別するために得られる細胞から収穫された gDNA を12です。 簡単に言えば、コピー数滴デジタル PCR 試金を使用して、GFP の 1 つまたは 2 つのコピーとドナー テンプレート プラスミド バックボーン統合を含むクローンを識別できます。[エンドポイント PCR の試金とサンガー シーケンス処理することができますの組み合わせは、正確な挿入を含むクローンを識別します。 雪解けには、氷の粒を溶かすため慎重に見て、組織培養のインキュベーターで 37 ° C にプレート全体をもたらします。プレートの端に井戸は、まず解凍する傾向があります。 RT 成長培地 10 μ M Ri と 211 × g で遠心する室温 3 分の 3 mL を含む 15 mL の円錐管に全体 200 μ L を優しく転送望ましいクローンの氷ペレットが溶けると 上清を吸引し、10 μ m Ri 補われる RT 成長媒体の 1 mL の小球形にされた細胞を再懸濁します。新鮮なマトリックス膜 24 ウェル プレートに移し、37˚C と 5% CO2で孵化させなさい。メディアを 24 h で、通常成長媒体 (Ri なし) に変更し、クローンで 60-80% の confluency に達すると、成熟した形態19まで 72 96 h のすべての 24 h 細胞を送り続けます。