JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Endogene eiwit Tagging in mens geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9

Published: August 25, 2018
doi:
10.3791/58130
, , , , ,
1Allen Institute for Cell Science

Summary

Hier wordt beschreven, is een protocol voor tagging endogeen uitgedrukt eiwitten met fluorescerende codes in menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9. Vermoedelijk bewerkte cellen zijn verrijkt door fluorescentie geactiveerd cel Sorteren en klonen cellijnen worden gegenereerd.

Abstract

Een protocol wordt voor het genereren van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) dat uitdrukkelijke endogene eiwitten gesmolten om in-frame N – of C-terminaal fluorescerende labels gepresenteerd. De prokaryote CRISPR/Cas9-systeem (geclusterde regelmatig interspaced kort palindromische herhalingen/CRISPR-geassocieerde 9) kan worden gebruikt om grote exogene opeenvolgingen in genomic loci via homologie geregisseerd reparatie (HDR). Om te bereiken de gewenste knock-in, dit protocol maakt gebruik van de ribonucleoprotein (RNP)-gebaseerde aanpak waar de wild type Streptococcus pyogenes Cas9 eiwit, synthetische 2-delige gids RNA (gRNA) en een donor sjabloon plasmide die aan de cellen via zijn geleverd Electroporation. Vermoedelijk bewerkte cellen uiten de fluorescently tagged eiwitten zijn verrijkt door fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACS). Klonen lijnen worden vervolgens gegenereerd en kunnen worden geanalyseerd voor precieze editing resultaten. Door de invoering van de fluorescerende code aan de genomic locus van een gen van belang, kan de resulterende subcellular localisatie en de dynamiek van het fusie-eiwit worden bestudeerd onder endogene regelgevende controle, een belangrijke verbetering ten opzichte van conventionele overexpressie systemen. Het gebruik van hiPSCs als een modelsysteem voor gene tagging biedt de mogelijkheid te bestuderen van de tagged eiwitten in diploïde, nontransformed cellen. Aangezien hiPSCs kunnen worden onderscheiden in meerdere celtypen, biedt deze aanpak de mogelijkheid om te maken en studeren tagged eiwitten in een verscheidenheid van isogene cellulaire contexten.

Introduction

Het gebruik van genoom-bewerken strategieën, met name CRISPR/Cas9, om cellulaire processen te bestuderen is steeds meer en meer toegankelijk en waardevolle1,2,3,4,5, 6 , 7. een van de vele toepassingen van CRISPR/Cas9 is de invoering (via homologie geregisseerd reparatie (HDR)) van grote exogene sequenties zoals GFP in specifieke genomic loci dat dan als verslaggevers voor de activiteit van een gen of eiwit product8 dienen . Deze techniek kan worden gebruikt om een opeenvolging van fluorescerende eiwit toevoegen aan een endogene open leesraam waar de resulterende endogeen gereglementeerde fusieproteïne kan worden gebruikt om te visualiseren de subcellular localisatie en de dynamiek van de proteïne van belang5 ,6,9,10,11. Terwijl endogeen tagged eiwitten vele voordelen ten opzichte van overexpressie systemen bieden, is invoegen van grote sequenties in het menselijk genoom een inefficiënt proces meestal eist een selectie of verrijking strategie te verkrijgen van een bevolking van cellen die kunnen worden gemakkelijk bestudeerde5,12.

Dit protocol beschrijft de invoeging van een DNA-sequentie een fluorescente proteïne (FP)-codering in een gewenste genomic locus. Het protocol bevat ontwerp en levering van de donor sjabloon plasmide, en de ribonucleoprotein (RNP) complexe (wild type S. pyogenes Cas9 eiwit gecombineerd met synthetische CRISPR RNA (crRNA) en activeren van trans crRNA (tracrRNA)). Ook beschreven is een verrijking van het vermeende bewerkte cellen via fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACS) en het klonen cel proces voor de generatie van de lijn. Tot op heden is deze methode gebruikt voor het genereren van hiPSC lijnen met monoallelic of (zelden) bi-allèlique groen fluorescente proteïne (GFP) tags labeling van vijfentwintig eiwitten vertegenwoordigen belangrijke cellulaire structuren. De resulterende bewerkte cellen van deze inspanningen hebben bevestigd te hebben van het verwachte genetische inbrengen, een correct lokaliseren fusieproteïne express en handhaven pluripotent en een stabiele karyotype12 (en niet-gepubliceerde gegevens). Deze methode is ook gebruikt voor het genereren van meerdere andere single en dual (twee verschillende eiwitten gelabeld in dezelfde cel) bewerkt populaties van hiPSCs (niet-gepubliceerde gegevens).

Menselijke iPSCs afgeleid van een gezonde donor werden gekozen voor deze inspanningen genoom-bewerken omdat, in tegenstelling tot veel conventionele cellijnen, ze zijn diploïde, karyotypisch stabiele, niet-getransformeerd en proliferatieve. Deze eigenschappen bieden een aantrekkelijk model voor het bestuderen van de fundamentele celbiologie en modellering van de ziekte. Bovendien, het potentieel van de differentiatie van hiPSCs biedt de mogelijkheid te bestuderen van meerdere ontwikkelingsstadia parallel over verschillende geslachten en celtypes isogene cuvetten met inbegrip van organoids, weefsels en “ziekte in een schotel” modellen13 ,14,15. Terwijl dit protocol werd ontwikkeld voor hiPSCs (WTC-lijn), is het mogelijk dat het informatief voor de ontwikkeling van protocollen met behulp van andere zoogdieren cellijnen.

Protocol

1. in Silico ontwerp van crRNA en Donor sjabloon plasmide voor FP Knock-in Verkrijgen van de volgorde van de geannoteerde referentie van NCBI16 of de UCSC Genome Browser17 (e.g., GenBank format) van het gen van belang en deze importeren in een bio-informatica software van keus. Als de host-genoom is bekend bevatten varianten ten opzichte van de referentie, behoren die nu door het aanpassen van de volgorde van de verwijzing in de bio-informatica software (zie discussie). Ga naar de gewenste FP invoeging site. Voor C-terminal codes, zal de volgorde voor de FP-tag worden ingevoerd tussen de laatste voet van de laatste codon en het eerste honk voor de stop codon. Voor N-terminale tagging, zal meestal de volgorde voor de FP-tag worden ingevoerd tussen de laatste voet van de start codon en het eerste honk voor de volgende codon. In sommige gevallen, zoals wanneer de start codon is een enkel codon exon, of waar een reeks signaal bestaat in de buurt van het eindpunt van de eiwitten, mag de gewenste FP invoeging site gelegen zijn in een meer 3ʹ standpunt, zolang het blijft in frame. Gebruik 50 bp aan weerskanten van de gewenste invoegpositie-site als de volgorde van de input voor een openbaar crRNA ontwerptool. Na 2-4 crRNA doelstellingen worden vastgesteld in de buurt van de plaats van de invoegpositie, aantekeningen maken de crRNA bandplaatsen en protospacer-aangrenzende motief (PAM) sequenties (NGG) in de bio-informatica software. Deze crRNAs zal worden gebruikt voor het opwekken van dubbele gestrande einden (zie bespreking voor meer instructies voor het ontwerp van de crRNA).Opmerking: Aangepaste crRNA sequenties kunnen worden ingediend voor synthese met een commerciële leverancier (aanbevolen), of de volgorde kan worden gebruikt als uitgangspunt voor het ontwerpen van een klonen of in vitro synthese-strategie, die buiten het bestek van dit protocol valt (zie bespreking ). Om te beginnen de donor sjabloon plasmide, 1 kb van volgorde stroomopwaarts van de gewenste invoegpositie-site gebruiken als de takken van de 5ʹ-homologie (dit geldt voor de start codon voor N-terminale invoegingen), en 1 kb van sequentie stroomafwaarts van de gewenste invoegpositie-site als de 3ʹ gebruiken homologie arm (dit geldt voor de stop codon voor C-terminal invoegingen). Bases tussen de twee takken van de homologie worden meestal niet overgeslagen. Met inbegrip van cellijn specifieke varianten in de armen van de homologie zal deze genetische varianten in de resulterende bewerkte cellen behouden. Tussen de twee takken van de homologie, invoegen de volgorde voor de FP (of andere reeks knock-in) en de volgorde van de linker (zie bespreking voor meer begeleiding op linkers). Voor N-terminal codes moet de linker volgorde rechtstreeks 3ʹ van het KP; voor C-terminal codes moet de linker volgorde rechtstreeks 5ʹ van het KP. CrRNA bandplaatsen in het plasmide sjabloon donor ter voorkoming van Cas9 snijden van donor reeks verstoren (zie bespreking voor overwegingen bij het wijzigen van crRNA bandplaatsen). Indien mogelijk, heeft verstoring van de PAM in een reeks dan NGG of NAG de voorkeur. Als alternatief, invoering van puntmutaties aan drie basen in de zaad-regio van de crRNA (10 honken proximale aan de PAM) is voorspeld dat voldoende verstoren crRNA bindend. Sommige bandplaatsen crRNA worden verstoord door de invoering van de FP opeenvolging in de donor sjabloon plasmide; ervoor zorgen dat geen PAM, of intact bindende regio nog steeds in deze gevallen bestaat.Opmerking: In silico donor sjabloon plasmide voor gene synthese kan worden ingediend door een commerciële leverancier, of het kan worden gebruikt als uitgangspunt voor het ontwerpen van een strategie van klonen, die buiten het bestek van dit protocol valt. Een eenvoudige backbone zoals pUC19 of pUC57 is voldoende. 2. ribonucleoprotein (RNP) transfectie voor CRISPR/Cas9 gemedieerde Knock-in hiPSCs Opmerking: In dit protocol, de term ‘gRNA’ beschrijft synthetische crRNA en de tracrRNA goed opnieuw geschorst, gekwantificeerde en pre-complexvorm per de instructies van de fabrikant (Zie Tabel van materialen). Aanvulling op alle media met 1% penicilline streptomycine. Kweken van de hoofdlijnen van de WTC hiPSC lijn worden beschreven in meer detail op de Allen cel Explorer18,19. WTC hiPSCs worden gebruikt in dit protocol, maar met de juiste transfectie optimalisatie, electroporation van RNP en donor sjabloon plasmide kan worden met succes aangepast aan andere celtypes. Bereiden van 10 µM werken voorraden gRNA en wild type S. pyogenes Cas9 eiwit2,20; Houd op ijs. Bereiden 1 µg/µL werken voorraad van donor sjabloon plasmide; bewaren bij kamertemperatuur (RT). PH 8,0 TE buffer gebruiken voor alle verdunningen. Een 6-well weefselkweek matrix beklede plaat met 5 mL verse groei media aangevuld met 10 µM ROCK remmer (Ri) per putje te bereiden. Houd plaat met media in de incubator op 37 ° C en 5% CO2 totdat u naar plaat cellen na de transfectie procedure (maximaal 2 uur).Opmerking: Alle matrix beklede platen gebruikt in dit protocol worden gemaakt door het toevoegen van dat een volume van ijskoude Matrigel verdund 1:30 in koude DMEM/F12 media volgens het Allen Instituut voor cel wetenschap protocol voor het kweken van de WTC hiPSC lijn19. Met behulp van een zachte eencellige dissociatie reagens zoals aanbevolen in de Tabel van materialen, passage hiPSCs in eencellige schorsing en graaf cellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller of hemocytometer.Opmerking: Een gedetailleerd protocol voor de WTC hiPSC regel hier gebruikt kan worden gevonden op de Allen cel Explorer19. Kort, cellen eens met RT DPBS wassen en behandelen met dissociatie reagens voor 3-5 minuten. Vervolgens triturate cellen in één cel schorsing door zachte pipetteren en pellet door centrifugeren. Resuspendeer de pellet van levende cel in groei media aangevuld met 10 µM Ri. Bereiden een aliquoot deel van 1,84 x 106 cellen voor elke experimentele voorwaarde om te zijn transfected in aparte 1,5 mL tubes.Opmerking: Alle volumes worden berekend voor een volume van de totale reactie 4.5 µL in een 100 µL electroporation volume, tijden 2.3 reacties. Deze rekeningen voor dubbele transfectie en overtollige voor pipetting fout. Voorbereiden ribonucleoprotein (RNP) complexe buizen elke experimentele voorwaarde door toevoeging van 2.88 µL van 10 µM gRNA en 2.88 µL van 10 µM Cas9 tot een 1,5 mL koker. Incubeer bij RT gedurende een minimum van 10 minuten (maximum 1 uur). Pellet één cel aliquoot (bereid in stap 2.3.1) 211 x g gedurende 3 minuten op RT. Aspirate supernatant en resuspendeer de pellet cel in 220 µL van fabrikant electroporation buffer. Voeg 220 µL van de geresuspendeerde cellen uit stap 2.5 in de 1,5 mL RNP complexe buis bereid in stap 2.4. Voeg 4,60 µL van 1 µg/µL donor sjabloon plasmide aan de 1,5 mL-buis bereid in stap 2.4. Gebruik de nucleofection uiteinde en Pipetteer om te mengen de buis inhoud 2 – 3 keer, dan 100 µL van schorsing naar het bereid electroporation apparaat. Vermijd invoering van alle bubbels in de tip. Toepassing 1300 V voor 1 pulse van 30 ms. Zachtjes spoel de suspensie in de plaat 6-well bereid uit stap 2.2 met een wervelende beweging. Cellen verspreiden door zachtjes de plaat links-naar-rechts en van voor naar achter te bewegen. Met behulp van een nieuwe nucleofection-tip, herhaal stap 2.8-2.9 met de resterende 100 µL van schorsing en overdracht in een tweede putje van de plaat 6-well bereid. Herhaal stap 2.4 via 2.10 voor elke gRNA en donor sjabloon plasmide combinatie, met inbegrip van niet-targeting gRNA, donor sjabloon plasmide alleen en buffer alleen besturingselementen. Zorg te wijzigen van de uiteinden van de pipet en nucleofection te voorkomen van kruisbesmetting. Incubeer transfected cellen bij 37 ° C en 5% CO2. De media omzetten regelmatige groei media (geen Ri) bij 24 h, en blijven voeden hiPSCs elke 24 h 72-96 uur, controle van confluentie. Wanneer hiPSCs 60-80% samenvloeiing bereiken, gaat u verder met stap 3.Opmerking: Zware celdood (> 70%, geschat) normale 24-48 h na de transfectie is. 3. FACS-verrijking van vermeende bewerkt hiPSCs Opmerking: Bij het sorteren van stamcellen, passen instrumentele instellingen ter bevordering van de overleving van de cel als in de discussie wordt voorgesteld. Kort, gebruik de grootste mondstuk mogelijk (130 µm), een laag debiet (≤ 24 µL/min), conserveermiddel-vrije schede vloeistof (zoals zoutoplossing, Zie Tabel of Materials), en de lage monster druk (10 psi). Voorafgaand aan het begin van een experiment FACS, media omzetten in groei media aangevuld met 10 µM Ri en cellen bij 37 ° C en 5% CO2 voor 2-4 h ter bevordering van de overleving na FACS uit te broeden. Met behulp van een zachte eencellige dissociatie reagens zoals aanbevolen in de Tabel van materialen, passage hiPSCs in eencellige suspensie in groei media aangevuld met 10 µM Ri19. Filtreer hiPSC schorsing door 35 µm mesh filter in polystyreen Rondbodemkolf buizen. Sorteren van cellen met behulp van voorwaartse scatter en kant scatter (inclusief hoogte vs. breedte) puin en paren uit te sluiten. Gebruik live, buffer alleen controle cellen in te stellen van de FP-positieve-poort, zodat < 0.1% van de buffer enige cellen vallen binnen de poort. Sorteren de gehele bevolking van FP-positieve cellen in een 1,5-15 mL polypropyleen buis met 0,5-2 mL RT groei media aangevuld met 10 µM Ri.Opmerking: Polypropyleen vermindert de kans op cel adhesie aan de plastic. Centrifugeer verzamelde cellen bij 211 x g gedurende 3 min op RT. Zorgvuldig gecombineerd supernatant en resuspendeer de pellet cel in 200 µL van groei media aangevuld met 10 µM Ri. Tot 3.000 gesorteerde cellen overbrengen in een enkel putje van een vers matrix beklede 96-wells-plaat19.Opmerking: Met geschikte setup, cellen kunnen ook worden gesorteerd (in bulk) rechtstreeks in een enkel putje van een 96-Wells-weefselkweek matrix beklede plaat met 200 µL van groei media aangevuld met 10 µM Ri bij een aanbevolen dichtheid van 1000-3000 cellen per putje voor hiPSC. Incubeer gesorteerde cellen bij 37 ° C en 5% CO2. De media omzetten in groei media aangevuld met 5 µM Ri op 24u. Op 48 h beginnen voeden cellen regelmatige groei media (geen Ri) elke 24 h 72-96 uur, controle van confluentie. Overleven na FACS wordt geschat op meer dan 50% als een minimum van 500 cellen worden overgeënt in een put van een 96-wells-plaat. HiPSCs bereiken van 60-80% samenvloeiing als volwassen morfologie (gladde, goed verpakt kolonie centra), doorgang in een groter formaat plaat zoals een 24-well-plate, dan van een 24-well-plate Toon in een 6-well-plaat. Wanneer de hiPSCs in een 6-well-plate bereiken van 60-80% samenvloeiing en Toon volwassen morfologie, uit te breiden naar een 100 mm plaat, opnieuw plaat voor imaging, cryopreserve of zaad op kloon plukken dichtheid (stap 4)19. 4. het genereren van vermeende klonale bewerkt hiPSC lijnen Met behulp van een zachte eencellige dissociatie reagens zoals aanbevolen in de Tabel van materialen, hiPSCs passage in eencellige schorsing en bepalen van het aantal cellen per mL19. Zaad 10.000 cellen van de bewerkte bevolking van hiPSCs op een vers matrix beklede 100 mm weefselkweek schotel met behulp van groei media aangevuld met 10 µM Ri19. De media omzetten in groei media zonder Ri 24 h na het zaaien en de hiPSCs met verse groei media elke 24 h feed voor 5-7 dagen. Als hiPSCs hebben gevormd kolonies die macroscopisch zichtbaar zijn (ongeveer 500 µm) zijn ze groot genoeg om te worden geïsoleerd. Bereid een matrix beklede 96-wells-plaat door zuigen overtollige matrix en het toevoegen van de 100 µL van groei media aangevuld met 10 µM Ri per goed19. Op een ontleden Microscoop gebruik een P-200 Pipetteer, of vergelijkbaar, voorzichtig schrapen en gecombineerd afzonderlijke kolonies van het oppervlak van de plaat. Overdracht van volume (~ 20-100 µL) met de kolonie aan een enkel putje van de 96-wells-plaat bereid in stap 4.3. Nadat alle kolonies zijn overgedragen, Incubeer de plaat in een incubator weefselkweek op 37˚C en 5% CO2. De media omzetten regelmatige groei media (geen Ri) bij 24 h, en blijven voeden cellen elke 24 h 72-96 uur tot kolonies hebben ongeveer verdrievoudigd in grootte (ongeveer 1500 µm).Opmerking: Het oppakken van 24-96 kolonies per crRNA gebruikt in de transfectie wordt aanbevolen. Voortbestaan van geïsoleerde klonen is meestal groter dan 95%. Met behulp van een zachte eencellige dissociatie reagens zoals aanbevolen in de Tabel van materialen, klonen passage hiPSC in een nieuwe matrix beklede 96-wells-plaat als volgt19. Met behulp van een 8-kanaals aspirator, verwijder en verwerp media uit de eerste kolom van de 96-wells-plaat. Met behulp van een meerkanaalspipet P-200, voeg ~ 200 µL van DPBS naar de eerste kolom van de 96-wells-plaat te wassen van de cellen. Met behulp van een 8-kanaals aspirator, verwijder en verwerp DPBS wassen uit de eerste kolom van de 96-wells-plaat. Met behulp van een meerkanaalspipet P-200, voeg 40 µL van dissociatie reagens naar de eerste kolom van de 96-wells-plaat. Herhaal de stappen 4.5.1-4.5.3 voor tot een totaal van zes kolommen van de 96-wells-plaat, omzetten in tips om zeker te zijn niet cross-besmetten wells. Plaats de plaat in de incubator 37 ° C gedurende 3-5 minuten vanaf het moment dat de dissociatie reagens werd toegevoegd aan de eerste kolom (stap 4.5.3).Opmerking: Het is aanbevolen om enige passage maximaal zes kolommen (48 wells) op een moment als gevolg van de tijd die nodig is voor het uitvoeren van deze stappen. Wanneer dit protocol voor de eerste keer uitvoert, start met slechts één of twee kolommen tegelijk passaging. Beperking van het aantal kolommen in één keer gepasseerd zorgt ervoor dat de cellen niet worden overgelaten in de dissociatie reagens te lang, die schadelijk voor hiPSCs zijn kan. Wanneer de cellen in de eerste kolom van de plaat zijn begonnen om te heffen van de onderkant van de plaat, kunt een meerkanaalspipet P-200 toevoegen 160 µL van DPBS naar de eerste kolom van de 96-wells-plaat en zachtjes triturate de cellen op de “12:00” , “3:00”, “6:00”, en “9:00” posities van elk putje. Het gehele volume van celsuspensie (200 µL) overbrengen in een V-bodem 96-wells-plaat. Herhaal stap 4.5.5 voor de resterende kolommen met cellen die dissociatie reagens in hen; tips over het niet cross-besmetten wells wijzigen Draai de plaat V-bodem in een centrifuge op 385 x g gedurende 3 minuten op RT. Met behulp van een meerkanaalspipet P-200, zachtjes Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 200 µL van nieuwe groei media aangevuld met 10 µM Ri per putje. Herhaal voor alle putjes, tips over het Kruis-vervuilt niet wijzigen. Alle van de celsuspensie overbrengen in een vers matrix beklede 96-wells-plaat19. Incubeer de plaat in een incubator weefselkweek bij 37 ° C en 5% CO2. De media omzetten regelmatige groei media (geen Ri) bij 24 h, en blijven voeden cellen elke 24 h 72-96 uur, totdat het grootste deel van de klonen samenvloeiing van 60-80 bereikt %.Opmerking: Deze passage helpt bij het uitspreiden van de cellen en zorgen voor meer groei over het hele gebied van de 96-wells-plaat. Observeren van klonen en identificeren van een geschikte splitsingsverhouding voor elke individuele kloon in de 96-wells-plaat (bijvoorbeeld 1:10 en 1:8). Met behulp van een zachte eencellige dissociatie reagens zoals voorgesteld in de Tabel van materialen, klonen passage hiPSC in een nieuwe matrix beklede 96-wells-plaat (stappen 4.5.1-4.5.8) overbrengen van een verhouding van de celsuspensie geschikt is voor elke kloon. Incubeer de plaat in een incubator weefselkweek op 37˚C en 5% CO2. De media omzetten regelmatige groei media (geen Ri) bij 24 h, en blijven voeden cellen elke 24 h 72-96 uur, totdat het grootste deel van de klonen samenvloeiing van 60-80 bereikt %, en tonen van rijpe morfologie.Opmerking: Elke kloon wellicht een verschillende splitsingsverhouding vanwege iets anders groei of het voortbestaan van de vorige passage, dus deze passage helpt te normaliseren van het aantal cellen per putje van elke kloon voor de bevriezing stap te volgen. Als gevolg van de verschillende tarieven van overleven en groeien, kunnen sommige klonen overwoekeren of niet groeien tijdens deze passaging stappen. De rest van de celsuspensie en pellet voor gDNA isolatie door centrifugeren cellen opslaan in een V-bodem 96-wells-plaat bij 385 x g gedurende 3 min op RT. verwijderen supernatant en gaat u verder met de isolatie van de gDNA met behulp van een 96-Wells-kit of opslaan plaat van Ingehuld cellen bij – 20˚C voor tot thr ee weken. 5. cryopreservatie van klonen cellijnen in 96-wells-plaat-indeling Met behulp van een reagens eencellige dissociatie, passage hiPSC klonen zoals hiervoor is beschreven (stappen 4.5.1-4.5.7). De bovendrijvende vloeistof met behulp van een meerkanaalspipet P-200 gecombineerd en resuspendeer in 60 µL van groei media aangevuld met 10 µM Ri. Herhaal voor alle putjes; tips over het Kruis-vervuilt niet wijzigen. 30 µL celsuspensie overbrengen in een niet-matrix gecoate weefselkweek 96-wells-plaat. Voegt u snel 170 µL bevriezing buffer (Zie Tabel van materialen) aan elk putje, zonder mengen. Herhalen door de overdracht van de resterende 30 µL van schorsing in een zus plaat en het toevoegen van 170 µL bevriezing buffer.Opmerking: Dit proces gebeurt in dubbele zus platen zodat een back-up-bevolking van cellen bestaat na het ontdooien van een van de afzonderlijke platen. Cryopreserved cellen ingebruikneming slechts om de andere kolom van een 96-wells-plaat zorgt voor sneller ontdooien (stap 5.6). Wikkel plaat met parafilm en plaatsen in een RT Styrofoam-doos met deksel. Plaats de gehele doos in een vriezer-80 ° C. Na 24 h kunnen platen worden overgebracht uit de doos piepschuim en opgeslagen bij – 80˚C voor maximaal vier weken.Opmerking: Terwijl de cellen tijdelijk bij-80 ° C opgeslagen worden, kunnen de kwaliteitscontrole van genetische tests worden uitgevoerd met de gDNA geoogst uit cellen verkregen in stap 4.6.1 teneinde de klonen om te ontdooien en propageren verder, zoals besproken in eerder gepubliceerde werk 12. kort, een kopie nummer druppel digitale PCR assay kan worden gebruikt voor het identificeren van de klonen die een of twee exemplaren van GFP en geen donor sjabloon plasmide ruggengraat integratie bevatten. Een combinatie van eindpunt PCR testen en Sanger sequencing kan vervolgens identificeren klonen die bevatten een precieze invoegen. Om te ontdooien, brengen de hele plaat tot 37 ° C in een weefselkweek incubator, zorgvuldig te kijken voor de pellets ijs te smelten. Putten aan de rand van de plaat neiging om eerst ontdooien. Wanneer de pellet ijs van gewenste kloon smelt, zachtjes hele 200 µL overbrengen naar een conische tube van 15 mL, met 3 mL RT groei media aangevuld met 10 µM Ri en centrifuge op 211 x g gedurende 3 minuten op RT. Gecombineerd supernatant en resuspendeer Ingehuld cellen in 1 mL RT groei media aangevuld met 10 µM Ri. Overbrengen naar een vers matrix beklede 24-well plaat en Incubeer bij 37˚C en 5% CO2. De media omzetten regelmatige groei media (geen Ri) bij 24 h, en blijven voeden cellen elke 24 h 72-96 uur totdat de kloon 60-80% confluentie bereikt en volwassen morfologie19 heeft.

Representative Results

Het doel van dit experiment moest zekering mEGFP (monomeer verbeterde GFP) aan de nucleaire lamin B1 eiwit door de invoering van de volgorde van de mEGFP aan het einde van de 5ʹ van het LMNB1 gen (N-terminus van het eiwit). Een linker (aminozuur volgorde SGLRSRAQAS) werd gekozen op basis van eerdere cDNA constructies uit de Michael Davidson Fluorescent proteïne collectie21. Omdat de regio bindende crRNA in het plasmide sjabloon donor voor elke kandidaat-crRNA werd verstoord na het inbrengen in silico van mEGFP en de volgorde van de linker, geen puntmutaties moest worden gemaakt te verstoren potentiële crRNA erkenning en decolleté door Cas9 van de donor sequentie (Figuur 1). De volgorde van de donor bevatte 1 kb homologie wapens flankerende beide uiteinden van de mEGFP-linker-reeks. De resulterende 2,734 bp van DNA werd gekloond in een pUC57-backbone, volgorde gecontroleerd, en de resulterende donor sjabloon plasmide werd gezuiverd met behulp van een endotoxine-gratis maxi prep. De donor sjabloon plasmide en RNP complexe transfected waren, vermoedelijk bewerkte cellen werden verrijkt en de lokalisatie van de mEGFP-nucleaire lamin B1 fusieproteïne werd bevestigd door fluorescentie microscopie (Figuur 2). Alleen de resultaten van de transfectie crRNA1 zijn hier beschreven, hoewel beide reeksen crRNA geproduceerd vermeende bewerkte populaties12. Vergeleken met de negatieve controle, die geen gRNA, Cas9 eiwit of donor sjabloon plasmide in de electroporation reactie (alleen buffer), de crRNA1 van de LMNB1 transfected cellen opgenomen 0,95% mEGFP-positieve cellen vertegenwoordigt de vermeende bewerkte mEGFP-nucleaire triplex B1 bevolking (Figuur 3a). Dit resultaat werd binnen het bereik van knock-in efficiencyverbeteringen waargenomen in vele genomic loci met behulp van deze methode als de eerder gemelde12. De mEGFP-positieve cellen waren geïsoleerd door FACS en beeld door levende microscopie te bevestigen verwachte lokalisatie van de mEGFP-nucleaire lamin B1 fusieproteïne aan de nucleaire envelop. Na FACS-verrijking waren ongeveer 90% van de gesorteerde cellen uit de LMNB1 crRNA1 bevolking mEGFP-positieve (zoals bepaald door microscopie), wat suggereert dat sommige mEGFP-negatieve cellen gezuiverd samen met het GFP-positieve cellen tijdens de sorteer procedure. Dit was een aanvaardbaar niveau van verrijking die toegestaan voor picken van 96 klonen die vervolgens genetisch gescreend kan worden voor het bewerken van de succesvolle. In het algemeen een cut-off voor succesvolle verrijking is 50% GFP positief. De meerderheid van de bevolking van de gesorteerde cel weergegeven fluorescentie bij de nucleaire envelop (nucleaire perifirie) in nondividing cellen en een uitgebreide nucleaire lamina binnen het cytoplasma tijdens de mitose bieden het vertrouwen in de juiste genomic bewerken op de LMNB1 Locus. De verrijkte bevolking bevatte cellen met ofwel helder of gedimd signaal. Dit verschil in de signaalsterkte kan duiden op een combinatie van juiste en onjuiste resultaten en hoogtepunten het nut van het genereren van een genetisch gevalideerde klonale lijn voor verdere studies (zie discussie) bewerken (Figuur 3b)12. Na klonale lijn generatie, gevalideerd genetisch cellen toonde uniforme GFP intensiteit in microscopie experimenten (Figuur 3 c). Figuur 1 . Strategie voor N-terminus GFP tagging van LMNB1 gen ontwerp. De tag GFP werd ontworpen voor N-terminal 5ʹ van het inbrengen van de eerste exon van LMNB1 gelegen op chromosoom 5. Zowel de 5ʹ als de 3ʹ-homologie wapens zijn 1 kb per stuk en meet tussen de start codon (ATG) en de tweede codon (homologie arms slechts gedeeltelijk weergegeven in figuur). Twee kandidaat-crRNAs werden ontworpen om het Cas9 te klieven zo dicht mogelijk bij de beoogde invoeging site mogelijk, terwijl nog steeds uniek in het genoom te begeleiden. Volgorde voor mEGFP en een aminozuur linker waren ingevoegde net 3ʹ van de start codon (mEGFP en linker volgorde niet op schaal). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2 . Werkstroom voor het produceren van endogeen gelabeld hiPSC klonen lijnen. Transfectie componenten, met inbegrip van het complex van de Cas9/crRNA/tracrRNA RNP (weergegeven als een rode Cas9 eiwit met gouden crRNA en paarse tracrRNA), de donor sjabloon plasmide met de homologie armen (HAs, getoond in goud), en FP + linker sequentie (afgebeeld in groen), werden electroporated. Na 4 dagen, werden de FP-positieve vermeende bewerkt cellen verrijkt door FACS uitgebreid als een populatie door alle gesorteerde cellen zaaien in een enkel putje van een 96-wells-plaat (~ 1000 cellen) en vervolgens uitgebreid in cultuur tot een werkende bevolking van ettelijke miljoenen cellen kunnen worden bepaald als de “verrijkte bevolking” (Zie Protocol stap 3.8). De opbrengst van de FP-positieve cellen verschilt per experiment als gevolg van variabele tarieven van HDR12; een succesvolle verrijking kan omvatten ~ 300-5.000 cellen na de transfectie van ongeveer 1.6 x 106 heupen cellen. Imaging voorstudies bevestigd het signaal en de lokalisatie van de fusie-eiwit in de verrijkte bevolking. Kolonies werden handmatig geplukt in een 96-wells-plaat voor uitbreiding en cryopreservatie. Verdere genomic kwaliteitscontrole screening met druppel digitale PCR (ddPCR) en andere PCR-gebaseerde testen dan gewend was goed bewerkte klonen, als eerder beschreven12identificeren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3 . Verrijking van vermeende bewerkte cel populaties. (A) stroom cytometry percelen van de LMNB1 cellen vier dagen na transfectie bewerkt. De y-as weergegeven GFP intensiteit en de x-as weergegeven voorwaartse scatter. Sorteer poorten waren ingesteld op basis van het besturingselement alleen-buffer. Aangezien hiPSCs gevoelig voor verstoring zijn, live/dode vlek werd weggelaten en een zeer conservatieve FSC/SSC-gate in plaats daarvan werd gebruikt. (B) na verrijking, de bevolking van LMNB1 Cr1 bewerkt cellen toonde ~ 90% van de cellen met het GFP lokaliseren aan de nucleaire envelop (verwachte LMNB1 lokalisatie). De bevolking bevatte cellen van verschillende GFP intensiteit evenals sommige cellen GFP-negatief. Schaal bars zijn 10 micron. (C) na klonale lijn generatie toonden de cellen een uniforme GFP-intensiteit, met enkele celcyclus afhankelijke verschillen. De bar van de schaal is 20 micron.

Discussion

De methode die hier gepresenteerd voor het genereren van endogeen geregeld fluorescent proteïne fusies in hiPSCs is een veelzijdige en krachtige aanpak voor het genereren van gene bewerkt cellijnen met toepassingen variërend van levende cellen imaging tot verschillende functionele studies en ” ziekte in een schotel”modellen met behulp van de patiënt-afgeleide hiPSC lijnen13,14,15. Terwijl deze methode heeft gebruikt om grote FP tags aan de N – of C-terminus van endogene eiwitten, zou het kunnen worden gebruikt om andere tags of kleine genetische veranderingen kennismaken met model of juiste ziekte-veroorzakende mutaties22,23 . Voor kleinere inzetstukken, de grootte van de homologie-arm kan worden verminderd, maar de algemene benadering voor het bewerken van gepresenteerd in deze methode gelden nog steeds24,25. Terwijl het gebruik van hiPSCs sterk aangemoedigd voor hun enorme nut, met zorgvuldige optimalisatie wordt, kan dit protocol worden aangepast om het bewerken van het genoom van andere zoogdieren cellijnen.

Bij het bepalen van een gen van belang voor FP tagging, transcript overvloed schat (van microarray of RNA-Seq gegevens) zijn een goed uitgangspunt voor de beoordeling of een gen of isovorm van belang is uitgedrukt, hoewel transcript niveaus niet altijd met correleren doen eiwitniveaus. De hier beschreven FACS-verrijking-strategie het beste werkt voor genen die minstens matig goed worden uitgedrukt in het celtype van belang. Deze strategie ook succesvol geweest bij de keuze voor fusies die punctate en/of discrete lokalisatie patronen zoals centrin, desmoplakin en paxillin laten zien waar het signaal naar verhouding van de achtergrond is zeer laag12,19. Genen die zijn niet sterk uitgedrukt of alleen worden uitgedrukt in afgeleide celtypes mogelijk aanvullende selectie strategieën.

Het uitgangspunt voor crRNA en donor sjabloon plasmide ontwerpen gebruikt in menselijke cellijnen moet de referentie van de menselijke genoom (GRCh38). Omdat het genoom van verschillende cellijnen kunnen variëren binnen dezelfde soort, en CRISPR/Cas9 volgorde-specifieke, is het zeer nuttig om te identificeren cel lijn-specifieke varianten (één nucleotidepolymorfisme of ingevoegde/verwijderde (microdeleties)) dat verschilt van het genoom van de verwijzing en deze in het ontwerp opnemen. Dit zorgt ervoor dat crRNAs verenigbaar met het genoom van de host zijn zal en dat de donor sjabloon plasmide homologie armen cellijn specifieke varianten zal behouden. Een voorgestelde strategie is homozygoot varianten geïntegreerd in crRNAs en donor sjabloon plasmide homologie wapens tijdens het ontwerpproces. Opnemen van heterozygoot varianten is optioneel. De specifieke reagentia gebruikt voor grote knock-in experimenten en andere belangrijke overwegingen voor dit protocol worden hieronder besproken.

Cas9 eiwit

Het belangrijkste voordeel van het gebruik van Cas9 eiwit is dat de invoering van de Cas9 en gRNA als een complexe RNP is aangetoond dat resulteren in een beperkte duur van de nuclease activiteit t.o.v. plasmide-gebaseerde benaderingen waar de uitdrukking van de Cas9 en de gRNA kan blijven voor dagen en leiden bij grotere op – en af-streefpad activiteit26,27. Een bijkomend voordeel van het gebruik van Cas9 eiwit is dat het gemakkelijk verkrijgbaar zijn voor eenmaal in de cellen klieven. Dit staat in contrast met de meer conventionele methodes van het gebruik van Cas9 mRNA of Cas9/gRNA plasmide die vereisen transcriptie, vertaling en eiwit verwerking26,28. Wildtype S. pyogenes Cas9 eiwit is nu beschikbaar via vele commerciële bronnen.

Gids RNA

Er zijn vele algemeen beschikbare hulpmiddelen voor het vinden van de doelstellingen van de crRNA in de buurt van de gewenste FP invoeging site met nul of paar voorspelde af-doelen in de host genoom29,30,31,32. Efficiëntie in HDR en de precisie van de HDR resultaten lopen sterk uiteen tussen crRNA doelen gebruikt op een bepaald locus12. Om deze reden, het testen van verschillende crRNAs (2-4, en bij voorkeur binnen 50 bp van de gewenste invoegpositie site) per locus wordt aanbevolen, omdat dit de kans op een succesvolle bewerken experiment verhogen kan. Huidige mogelijkheden voor het leveren van gRNA zijn synthetische 2-delige crRNA en tracrRNA, synthetische één gRNAs (sgRNAs), in vitro sgRNAs, of het leveren van een plasmide naar de cellen die uiting geven aan de sgRNA van de promotor van een U6 getranscribeerd. Dit protocol is niet geoptimaliseerd voor hoge decollete activiteit. Ongewijzigde 2-delige crRNA en tracrRNA (Zie Tabel van materialen) werden gebruikt met als doel het genereren van mono-allèlique FP-gelabeld cellijnen terwijl veroorzaakt de minste potentiële verstoring naar de cellen.

Donor sjabloon plasmide

Omdat sommige van de homologie arm reeks voorwaarde bij de donor sjabloon plasmide zullen worden opgenomen in het genoom van de gastheer tijdens het evenement HDR, moeten puntmutaties naar de crRNA erkenning sites worden ingevoerd om te voorkomen dat verdere decolleté door Cas9 na HDR. Vaak is de eenvoudigste storend verandering om muteren van de PAM-reeks. Omdat sommige niet-canonieke PAM sequenties kunnen nog steeds worden herkend door wild type S. pyogenes Cas9, is het beste gebruik van NGG, NAG of NGA33te vermijden. Wanneer muteert de homologie-arm, te voorkomen dat niet-synoniem mutaties en de invoering van zeldzame codonen. Als een synoniem wijziging in de volgorde van de PAM niet mogelijk is, overwegen drie synoniem puntmutaties in de zaad-regio (10 bp proximale aan PAM) van de crRNA binding site. Uiterste zorg moet worden genomen bij het maken van deze veranderingen in de 5ʹ niet-vertaalde regio (UTR), aangezien deze regio’s kunnen belangrijke regulerende sequenties bevatten. Raadplegen van een genetische behoud database zoals de UCSC Genome Browser vergelijkende genomica tracks kunnen begeleiden in deze gevallen, zoals wijzigingen in grondslagen niet-geconserveerd kunnen beter worden getolereerd, dan verandert in zeer geconserveerde honken17. Soms is de loutere invoeging van de FP opeenvolging genoeg te verstoren de crRNA binding site (zoals in Figuur 1); echter, de nieuw toegevoegde volgorde moet worden gecontroleerd op de persistentie van crRNA-bindende en PAM-sequenties.

Aminozuur linkers tussen de FP en de inheemse proteïne worden aanbevolen voor de instandhouding van de functie van de fusie-eiwit34. Vaak is een aminozuur linker kan worden gekozen voor de specifieke lading of de grootte. Als een cDNA fusie met een ontwerp dat vergelijkbaar is met de gerichte endogene is fusieproteïne goed onderzocht, dat dezelfde linker kan gebruikt worden voor de CRISPR/Cas9 knock-in experiment12,19. Als deze informatie niet beschikbaar is, een korte linker zoals GTSGGS ook al met succes12gebruikt. Andere studies hebben aangetoond dat succes met een opeenvolging van de generieke kleine 3-amino acid linker voor allerlei doelen35.

Transfectie en FACS verrijking

Vele verkrijgbare transfectie reagentia zijn geformuleerd voor levering van bepaalde soorten moleculen aan cellen, overwegende dat een electroporation systeem kan worden gebruikt voor het leveren van reagentia met een breed scala van samenstelling, grootte en kosten. Naast het feit dat een gemeenschappelijke methode van de transfectie voor hard-aan-transfect cellen zoals hiPSCs, draagt electroporation ook het voordeel van het leveren van alle drie de componenten voor CRISPR/Cas9-gemedieerde FP knock-in, zoals wordt beschreven in deze methode. Electroporation bleek te produceren de beste resultaten in vergelijking met andere verkrijgbare reagentia bij de ontwikkeling van deze methode (gegevens niet worden weergegeven), en is ook door anderen gebruikt voor RNP levering26,28,36 .

Wanneer dit protocol wordt gebruikt voor het bewerken van hiPSCs, moet speciale zorg worden getroffen om zachte behandeling van de cellen vóór en na het gen proces voor de overleving van de cel van de optimale en minimale spontane differentiatie bewerken. In het bijzonder de FACS verrijking methoden moeten worden aangepast om stamcellen te sorteren met behulp van de grootste mondstuk mogelijk (130 µm), een laag debiet (≤ 24 µL/min), conserveermiddel-vrije schede vloeistof (zoals zoutoplossing, Zie Tabel of Materials), en de lage monster Druk (10 psi). In plaats van één cel sorteren, wat in suboptimaal levensvatbaarheid in de cellen van de stam resulteert, de hiPSCs FACS verrijkte gesorteerd in bulk en uitgebreid als een populatie te optimaliseren cel levensvatbaarheid en stamcel integriteit. Eencellige sorteren kan evenwel geschikt is voor minder gevoelige celtypes. Ter bevordering van de overleving van de cel, cellen geretourneerd naar cultuur niet langer dan één uur na de oogst voor de FACS verrijking en bewaard bij kamertemperatuur gedurende het sorteren proces. Voor sommige celtypen, kan overleving van de cel ook verbeterd worden door drachtige cellen op ijs (4° C) tijdens het sorteren proces.

De uitbreiding van de bulk van de FP-positieve cellen biedt een kans om de populatie evalueren door imaging analyse voor fusion eiwit lokalisatie voorafgaand aan klonale krommen. Terwijl de resulterende verrijkt bevolking van cellen voldoende voor sommige studies zijn kan, tonen deze populaties vaak FP signaal van wisselende intensiteit. De geïsoleerde klonale lijnen hebben uniforme signaal (Figuur 3), waardoor ze geschikter voor functionele experimenten12.

Cel klonale lijn generatie

Tijdens het bewerken en klonale lijn generatie proces is het belangrijk om te controleren van de morfologie van de cel. hiPSC kolonies gegroeid in feeder-vrij voorwaarden moeten vertonen, gladde randen en een zelfs, goed verpakt centrum12,18,19. Gedifferentieerde cellen moeten worden geobserveerd in minder dan 5% van de cultuur. Bij het afhalen van afzonderlijke kolonies, kies degenen die goede morfologie van de tentoonstelling. Tijdens de 96-wells-plaat passaging gebeurtenissen, Controleer klonen voor morfologie en staken die begroeid zijn als dit kan tot differentiatie leiden dan een indicatie van genetische instabiliteit.

Generatie van klonen cellijnen zorgt voor genetische bevestiging van precieze editing, dat is belangrijk omdat Cas9-geïnduceerde dubbele streng breekt in het genoom zijn vaak gerepareerd vaag ondanks de opname van de tag op de gewenste plaats. Eerder beschreven PCR-gebaseerde testen is gebleken dat cumulatief over tien unieke genomic loci vele (45%) van de FP-uiten klonen leed van donor plasmide ruggengraat integratie bij de gerichte locus of (zelden) willekeurig in de genoom-12. Bovendien, 23% van GFP-positieve klonen (n = 177) over tien unieke loci bleken haven mutaties op of in de buurt van de verwachte crRNA snijden site in het niet-gelabelde allel, meest waarschijnlijk te wijten aan NHEJ12. Deze genetische analyse van vele klonen lijnen (~ 100 klonen/bewerken) onderstreept het belang van genetische validatie is niet mogelijk in een celpopulatie aangezien FP-expressie en verwachte fusion eiwit localisatie alleen bieden geen garantie voor precieze bewerken12 . Bovendien, kunnen niet deze PCR-gebaseerde testen worden uitgevoerd op een verrijkte bevolking van cellen met enige zekerheid, die rechtvaardigen de noodzaak voor klonale lijn generatie voordat zinvolle analyse kan worden voltooid. Genetische bevestiging van de ingevoegde FP-tag en verificatie van de genetische integriteit van het onbewerkte allel (in een mono-allèlique bewerkte kloon) zijn beide noodzakelijk zijn om de precieze bewerken op de gerichte locus buiten de labelexpressie.

Een laag tarief van bi-allèlique bewerkingen en gebrek aan af-target mutaties (zoals getest door Sanger en exome sequentiebepaling) geconstateerd tot nu toe met behulp van deze methode (niet-gepubliceerde gegevens)12. Dit is in overeenstemming met eerdere studies met een beschrijving van het gebruik van korte durende RNP voor CRISPR/Cas9 experimenten26,27. Het ontbreken van klonen cellijnen met bi-allèlique bewerkingen mogelijk ook specifieke locus of gelabeld als gevolg van het onvermogen van de cel te tolereren twee exemplaren van een essentieel eiwit zoals voorgesteld eerder gepubliceerde experimenten waar vermeende bi-allèlique bewerkte cellen waren waargenomen voor een locus (LMNB1), maar niet een andere (TUBA1B)12. Bi-allèlique volledig gevalideerde klonale cellijnen zijn gegenereerd met behulp van deze methode aan label ST6 bèta-galactoside alpha-2, 6-sialyltransferase 1 (ST6GAL1), en lid van het RAB5A RAS oncogen familie (RAB5A) met mEGFP19.

Na bevestiging van precisie voor de edit in het genoom, er zijn een verscheidenheid van kwaliteitscontrole tests die kunnen worden gebruikt om verder te karakteriseren de klonale lijn en klonen die voldoen aan alle cel van de stam, genomic, identificeren en cel biologische criteria voor gebruik in de toekomst studies . Cel biologische en functionele testen kunnen worden gebruikt ter bevestiging van de juiste expressie, lokalisatie en functie van de fusie-eiwit12. De vergelijking met onbewerkte ouderlijk zal helpen evalueren de invloed van het bewerkingsproces op lokalisatie, dynamiek en functie. Andere testen bepalen, zoals analyse van de groei en tests voor genomic stabiliteit kunnen ook helpen of het gecodeerde eiwit storende naar de cel. Bij het gebruik van hiPSC in dit protocol, evaluatie van pluripotent markeringen en differentiatie mogelijkheden kan van doorslaggevend belang bij het bepalen van een kloon die is waardevol voor stroomafwaarts bestudeert12. Omdat cultuur van uitgebreid hiPSC heeft aangetoond dat leiden tot genetische instabiliteit, toezicht op de groei en karyotype van klonen cellijnen is ook belangrijk12,37. Echter bedoeld de finale gebruik van de bewerkte cellen zal uiteindelijk beslissen over het niveau en de breedte van de kwaliteitscontrole analyse en zijn afhankelijk van de toepassing.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Daphne Dambournet voor vele inzichtelijke discussies en advies over gene bewerken, Thao ter illustratie, Angelique Nelson voor de kritische lezing van het manuscript, en Andrew Tucker voor het genereren van de mEGFP-gelabeld triplex B1 cellijn. Wij willen erkennen van de stamcellen en Gene Editing en Assay ontwikkelteams bij het Allen-Instituut voor de wetenschap van de cel voor hun bijdragen aan de gene bewerken en kwaliteitscontrole proces. De WTC-lijn die we gebruikt voor het maken van onze gen-bewerkt cellijn werd verstrekt door het Bruce R. Conklin Laboratory van de Gladstone instituten en UCSF. Wij danken het Allen Instituut voor cel wetenschap oprichter, Paul G. Allen, voor zijn visie, aanmoediging en steun.

Materials

Geneious R9 Biomatters, or similar bioinformatics software for in silico donor plasmid design
TE Buffer pH 8.0 IDT, or similar 11-01-02-05
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator, or similar ThermoFisher Scientific, or similar 51030408
Pipettes (1000 µL, 200 µL, 20 µL, 10 µL, 2 µL) Rainin, or similar
Pipette tips (1000 µL, 200 µL, 20 µL) Rainin, or similar
Multi-channel Pipette (200 µL) Rainin, or similar
Serological pipetes (25 mL, 10 mL, 5 mL) Costar, or similar
BRAND 8-Channel Manifold for Quiksip, Autoclavable Millipore Sigma, or similar BR704526-1EA use with non-filtered pipet tips, such as Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10, below
Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10 Thermo Fisher, or similar 3501-05
XP2 Pipette Controller Drummond, or similar 4-000-501
Disposable Pasteur Pipets VWR, or similar 53300-567
Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet CELLGARD, or similar NU-481
Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced Corning 354230 lot tested before use with hiPSC
DMEM/F12 (-phenol red) Gibco 11039-021 cold, for diluting Matrigel 1:30
mTeSR1 Complete Media StemCell Technologies 85850 recommended growth media for WTC hiPSC line
Penicillin-streptomycin Gibco 15070-063
WTC hiPSC line Coriell GM25256 the hiPSC line used in this protocol is available through Coriell
Tissue culture dish 100 mm Falcon 353003
6-well Cell Culture Plate CELLSTAR 657160
StemPro Accutase Gibco A11105-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) no calcium, no magnesium Gibco 14190144
15 mL polystyrene conical Sarstedt 62.554.100
Y-27632 (ROCK Inhibitor) StemCell Technologies 72308
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic crRNA, unmodified (custom sequence) Dharmacon Custom0247
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA Dharmacon U-002005-05
Recombinant wild-type Streptococcus pyogenes Cas9-NLS purified protein, 40 µM University of California-Berkeley QB3 Macrolab
Custom donor plasmid (PriorityGENE) Genewiz donor insert design was synthesized and cloned into pUC57 backbone by Genewiz
DNA LoBind Tube 1.5 mL Eppendorf 22431021
NucleoBond Xtra Maxi EF Clontech 740424.50
Neon Transfetion System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 100 µL kit ThermoFisher Scientific MPK10096
5 mL Polystyrene Round-bottom Tube with Cell Strainer Cap Falcon 352235
15 mL High Clarity Polyproylene Conical Tube Falcon 352196
FACSAriaIII Fusion BD Biosciences 656700
FACSDiva software BD Biosciences
FlowJo version 10.2 TreeStar
NERL Blood Bank Saline ThermoFisher Scientific 8504 used as preservative-free FACS Buffer
Olympus SZX7 Stereo Microscope, or similar Olympus, or similar
Tissue culture plate, 96-well Falcon 353072
96 well Cell Culture Plate, V-Bottom CELLSTAR 351180
CryoStor CS10 Sigma C2874-100ML used as cryopreservation buffer for cells in 96-well plate format
Parafilm Bemis PM-996
24 well Cell Culture Plate CELLSTAR 662160
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333 (6040), 307 (2011).
  2. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  3. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  4. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  5. Dambournet, D., Hong, S. H., Grassart, A., Drubin, D. G. Tagging endogenous loci for live-cell fluorescence imaging and molecule counting using ZFNs, TALENs, and Cas9. Methods in Enzymology. , 139-160 (2014).
  6. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Sci Rep. 5, 9592 (2015).
  7. Hendriks, W. T., Warren, C. R., Cowan, C. A. Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells: Approaches, Pitfalls, and Solutions. Cell Stem Cell. 18 (1), 53-65 (2016).
  8. Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
  9. Doyon, J. B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).
  10. Cho, W. K., et al. Super-resolution imaging of fluorescently labeled, endogenous RNA Polymerase II in living cells with CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Sci Rep. 6, 35949 (2016).
  11. White, C. W., Vanyai, H. K., See, H. B., Johnstone, E. K. M., Pfleger, K. D. G. Using nanoBRET and CRISPR/Cas9 to monitor proximity to a genome-edited protein in real-time. Sci Rep. 7 (1), 3187 (2017).
  12. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Mol Biol Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
  13. Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
  14. Young, J. E., Goldstein, L. S. Alzheimer’s disease in a dish: promises and challenges of human stem cell models. Human Molecular Genetics. 21 (R1), R82-R89 (2012).
  15. Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper. Stem Cell Reports. 3 (6), 931-939 (2014).
  16. . . Gene, NCBI- National Center for Biotechnology Information. , (2017).
  17. . . Gene, NCBI- National Center for Biotechnology Information. , (2017).
  18. . . Allen Cell Methods: Single cell passaging human iPS cells. , (2018).
  19. . . Allen Cell Explorer. , (2017).
  20. Lingeman, E., Jeans, C., Corn, J. E. Production of Purified CasRNPs for Efficacious Genome Editing. Curr Protoc Mol Biol. 120, 31-31 (2017).
  21. . . Michael Davidson Fluorescent Protein Collection. , (2017).
  22. Cox, D. B., Platt, R. J., Zhang, F. Therapeutic genome editing: prospects and challenges. Nature Medicine. 21 (2), 121-131 (2015).
  23. Haas, S. A., Dettmer, V., Cathomen, T. Therapeutic genome editing with engineered nucleases. Hamostaseologie. 37 (1), 45-52 (2017).
  24. Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases. G3 (Bethesda). 3 (4), 657-664 (2013).
  25. Orlando, S. J., et al. Zinc-finger nuclease-driven targeted integration into mammalian genomes using donors with limited chromosomal homology. Nucleic Acids Research. 38 (15), e152 (2010).
  26. DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. 121-122, 9-15 (2017).
  27. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  28. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
  29. Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).
  30. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
  31. Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  32. . . CRISPOR V4.3. , (2017).
  33. Zhang, Y., et al. Comparison of non-canonical PAMs for CRISPR/Cas9-mediated DNA cleavage in human cells. Sci Rep. 4, 5405 (2014).
  34. Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Adv Drug Deliv Rev. 65 (10), 1357-1369 (2013).
  35. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).
  36. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
  37. Baker, D., et al. Detecting Genetic Mosaicism in Cultures of Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 7 (5), 998-1012 (2016).

Tags

CRISPR/Cas9Endogenous Protein TaggingHuman Induced Pluripotent Stem CellsRibonucleoproteinFluorescent TagFACSClonal Cell LinesGene EditingLive Cell ImagingCellular StructuresCellular Processes

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (138), e58130, doi:10.3791/58130 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image