Una misura di cromatografia liquida ad alte prestazioni della chinurenina e acido chinurenico: materia biochimica di cognizione e di sonno in ratti
Summary
Alterazioni in metaboliti neuroattivi kynurenine pathway (KP) sono implicate nelle malattie psichiatriche. Indagando i risultati funzionali di un alterato kynurenine pathway metabolismo in vivo nei roditori può contribuire a delucidare approcci terapeutici innovativi. L’attuale protocollo combina approcci biochimici e comportamentali per studiare l’impatto di una sfida di chinurenina acuta nei ratti.
Abstract
La via della chinurenina (KP) di degradazione del triptofano è stata implicata nei disturbi psichiatrici. In particolare, l’Astrocita-derivati metabolita acido chinurenico (KYNA), un antagonista sia N-metilico-d-aspartato (NMDA) e α7 recettori nicotinici per l’acetilcolina (α7nACh), è stato implicato nei processi cognitivi nella salute e nella malattia. Come i livelli di KYNA sono elevati nei cervelli dei pazienti con schizofrenia, un malfunzionamento al glutamatergic e recettori colinergici è creduto per essere causalmente a disfunzione conoscitiva, un dominio di nucleo della psicopatologia della malattia. KYNA può svolgere un ruolo patofisiologico significativo in individui con la schizofrenia. È possibile elevare endogeno KYNA nel cervello del roditore di trattare gli animali con la chinurenina diretto bioprecursor e studi preclinici in ratti hanno dimostrato che le altezze acute in KYNA possono influenzare i processi di apprendimento e memoria. L’attuale protocollo descrive questo approccio sperimentale in dettaglio e combina un) un’analisi biochimica della chinurenina nel sangue e cervello formazione KYNA (mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni), b) comportamentali test per sondare la memoria contestuale hippocampal-dipendente (paradigma di evitare passivo) e c) una valutazione del comportamento di sonno-veglia [telemetriche registrazioni che unisce l’elettroencefalogramma (EEG) e segnali di elettromiografia (EMG)] in ratti. Presi insieme, una relazione tra elevati KYNA, sonno e cognizione è studiata, e questo protocollo viene descritto in dettaglio un approccio sperimentale alla comprensione dei risultati di funzione di elevazione chinurenina e KYNA formazione in vivo nei ratti. Risultati ottenuti attraverso le variazioni di questo protocollo metterà alla prova l’ipotesi che il KP e KYNA servono ruoli chiave nella modulazione del sonno e la cognizione negli Stati di salute e malattia.
Introduction
Il protocollo di Kyoto è responsabile di degradante quasi il 95% del triptofano aminoacido essenziale1. Nel cervello di mammifero, chinurenina presa in astrocytes è metabolizzata in neuroattivi piccola molecola KYNA principalmente dall’enzima chinurenina aminotransferasi (KAT) II2. KYNA agisce come un antagonista dei recettori NMDA e α7nACh in cervello2,3,4, e anche obiettivi recettori inclusi il ricevitore arilico dell’idrocarburo (AHR) e la G-proteina di segnalazione accoppiato recettore 35 (GPR35)5 ,6. In animali da esperimento, le elevazioni in cervello KYNA sono state indicate per alterare la loro prestazione conoscitiva in una matrice di analisi comportamentale2,7,8,9,10 . Un’ipotesi emergente suggerisce che KYNA svolge un ruolo integrale nella modulazione delle funzioni cognitive di un impatto di comportamento di sonno-veglia11, sostenendo così ulteriormente il ruolo di molecole derivate da astrociti nella modulazione della neurobiologia del sonno e cognizione12.
Clinicamente, le elevazioni in KYNA sono state trovate nel liquido cerebrospinale e tessuto cerebrale post mortem da pazienti con schizofrenia13,14,15,16, un debilitante disturbo psichiatrico caratterizzata da disturbi cognitivi. I pazienti con schizofrenia sono anche spesso afflitti da disturbi del sonno che possono esacerbare la malattia17. Comprensione del ruolo del metabolismo di KP e KYNA nella modulazione di una relazione tra il sonno e cognizione, in particolare tra apprendimento e la memoria, può condurre allo sviluppo di nuove terapie per il trattamento di questi scarsi risultati nella schizofrenia e altro malattie psichiatriche.
Un metodo affidabile e coerenza per la misurazione dei metaboliti di KP è importante assicurare che le ricerche emergenti da varie istituzioni possono essere integrata nella comprensione scientifica della biologia di KP. Attualmente, descriviamo la metodologia per misurare chinurenina nel plasma del ratto e KYNA nel cervello del ratto mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Il presente protocollo, che fa uso di una rilevazione fluorimetrica in presenza di Zn2 +, in primo luogo è stato sviluppato da Shibata18 e più recentemente adattato e ottimizzato per derivatizzare con 500 millimetri di acetato di zinco come il reagente post-colonna, consentendo la rilevazione di endogeno, quantità nanomolari di KYNA nel cervello11.
Per stimolare la produzione endogena di KYNA de novo come descritto nel presente protocollo, la chinurenina bioprecursor diretto viene iniettata intraperitonealmente (i.p.) in ratti. In combinazione con le valutazioni biochimiche per determinare il grado di produzione di KYNA, gli impatti di un chinurenina sfidano sulla memoria hippocampal-dipendente (paradigma di evitare passivo) e l’architettura di sonno-veglia (segnali EEG ed EMG) è anche indagate11. Una combinazione di queste tecniche consente lo studio dell’impatto biochimico e funzionale di un chinurenina sfida in vivo nei ratti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per una valutazione affidabile di KYNA nel cervello dopo somministrazione periferica chinurenina, è fondamentale per combinare e interpretare esperimenti biochimici e funzionali. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che permette nuovi utenti a stabilire efficaci metodi per misurare il plasma chinurenina e cervello KYNA dei ratti. La misura della chinurenina nel plasma ha confermato l’iniezione esatta e la misurazione del metabolita KYNA conferma la sintesi de novo nel cervello. Ci sono diversi vantaggi de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lo studio presente è stato in parte finanziato dal National Institutes of Health (R01 NS102209) e una donazione del Clare E. Forbes trust.
Materials
| Wistar rats | Charles River Laboratories | adult male, 250-350 g | |
| L-kynurenine sulfate | Sai Advantium | ||
| ReproSil-Pur C18 column (4 x 150 mm) | Dr. Maisch GmbH | ||
| EZ Clips | Stoelting Co. | 59022 | |
| Mounting materials screws | PlasticsOne | 00-96 X 1/16 | |
| Nonabsorbable Sutures | MedRep Express | 699B | CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12 |
| Absorbable Sutures | Ethicon | J310H | 4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1 |
| Dental Cement | Stoelting Co. | 51458 | |
| Drill Bit | Stoelting Co. | 514551 | 0.45 mm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alliance HPLC system | |||
| E2695 separation module | Waters | 176269503 | |
| 2475 fluorescence detector | Waters | 186247500 | |
| post-column reagent manager | Waters | 725000556 | |
| Lenovo computer | Waters | 668000249 | |
| Empower software | Waters | 176706100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Passive avoidance box for rat | |||
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | MedAssociates | ENV-018MD | Interior: 22"W x 22"H x 16"D |
| Center channel modulator shuttle box chamber | MedAssociates | ENV-010MC | |
| Stainless steel grid floor for rat | MedAssociates | ENV-010MB-GF | |
| Auto guillotine door | MedAssociates | ENV-010B-S | |
| Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat | MedAssociates | ENV-010MB-QD | |
| Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel | MedAssociates | ENV-221M | |
| Sonalert module with volume control for rat chamber | MedAssociates | ENV-223AM | |
| SmartCtrl 8 input/16 output package | MedAssociates | DIG-716P2 | |
| 8 Channel IR control for shuttle boxes | MedAssociates | ENV-253C | |
| Infrared source and dectector array strips | MedAssociates | ENV-256 | |
| Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080C | |
| Dual range constant current aversive stimulation module | MedAssociates | ENV-410B | |
| Solid state grid floor scrambler module | MedAssociates | ENV-412 | |
| Dual A/B shock control module | MedAssociates | ENV-415 | |
| 2' 3-Pin mini-molex extension | MedAssociates | SG-216A-2 | |
| 10' Shock output cable, DB-9 M/F | MedAssociates | SG-219G-10 | |
| Shuttle shock control cable 15', 6 | MedAssociates | SG-219SA | |
| Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080D | |
| PCI interface package | MedAssociates | DIG-700P2-R2 | |
| Shuttle box avoidance utility package | MedAssociates | SOF-700RA-7 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sleep-Wake Monitoring Equipment | |||
| Ponehmah software | Data Sciences International (DSI) | PNP-P3P-610 | |
| MX2 8 Source Acquisition interface | Data Sciences International (DSI) | PNM-P3P-MX204 | |
| Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit | Data Sciences International (DSI) | 271-0112-013 | |
| Dell 19" computer monitor | Data Sciences International (DSI) | 271-0113-001 | |
| Receivers for plastic cages, 8x | Data Sciences International (DSI) | 272-6001-001 | |
| Cisco RV130 VPN router | Data Sciences International (DSI) | RV130 | |
| Matrix 2.0 | Data Sciences International (DSI) | 271-0119-001 | |
| Network switch | Data Sciences International (DSI) | SG200-08P | |
| Neuroscore software | Data Sciences International (DSI) | 271-0171-CFG | |
| Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET | Data Sciences International (DSI) | 270-0134-001 |
References
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