Een High-performance Liquid Chromatography-meting van Kynurenine en Kynurenic zuur: Biochemie voor cognitie en slaap in ratten
Summary
Wijzigingen in de kynurenine traject (KP) neuroactive metabolieten zijn betrokken bij de psychiatrische ziekten. Onderzoek naar de functionele uitkomsten van een gewijzigde kynurenine traject metabolisme in vivo bij knaagdieren kan helpen nieuwe therapeutische benaderingen toelichten. Het huidige protocol combineert biochemische en gedragsmatige benaderingen voor het onderzoek naar de gevolgen van een acute kynurenine uitdaging bij ratten.
Abstract
De kynurenine traject (KP) van de afbraak van tryptofaan heeft betrokken bij psychiatrische stoornissen. In het bijzonder de Astrocyt afkomstige metaboliet kynurenic zuur (KYNA), een antagonist bij beide N-methyl-d-aspartaat (NMDA) en α7 nicotinerge acetylcholine (α7nACh) receptoren, heeft betrokken bij cognitieve processen bij gezondheid en ziekte. Als KYNA niveaus zijn verhoogde in de hersenen van patiënten met schizofrenie, wordt een storing bij de glutamaterge en cholinerge receptoren verondersteld om het causaal verband kunnen houden met cognitieve dysfunctie, een domein van de kern van de psychopathologie van de ziekte. KYNA kan een pathophysiologically belangrijke rol bij personen met schizofrenie. Het is mogelijk om te verheffen van endogene KYNA in de knaagdier hersenen door de behandeling van dieren met de directe bioprecursor kynurenine en preklinische studies bij ratten hebben aangetoond dat acute waterstand in KYNA mogelijk van invloed op hun processen voor leren en geheugen. Het huidige protocol beschrijft deze experimentele aanpak in detail en combineert een) een biochemische analyse van bloedspiegels kynurenine en hersenen KYNA vorming (met behulp van krachtige vloeibare chromatografie), b) gedrags testen om de sonde de hippocampal-afhankelijke contextuele geheugen (passieve vermijden paradigma), en c) een evaluatie van het slaap-waak gedrag [telemetrische opnamen combineren electroencephalogram (EEG) en electromyogram (EMG) signalen] bij ratten. Tezamen, een relatie tussen verhoogde KYNA, slaap en cognitie wordt bestudeerd, en dit protocol beschrijft in detail een experimentele aanpak voor het begrip van de functie resultaten van kynurenine hoogte en KYNA vorming in vivo bij ratten. Resultaten die zijn verkregen door middel van variaties van dit protocol zal het testen van de hypothese dat de KP en KYNA dienen een cruciale rol bij het moduleren van de slaap en cognitie in gezondheid en ziekte staten.
Introduction
De KP is verantwoordelijk voor bijna 95% van het essentiële aminozuur tryptofaan1vernederende. In de hersenen van zoogdieren, wordt kynurenine astrocyten rekening gemetaboliseerd in de neuroactive klein molecuul KYNA voornamelijk door het enzym kynurenine aminotransferase (KAT) II2. KYNA fungeert als een antagonist op NMDA en de α7nACh-receptoren in de hersenen2,3,4, en ook doelstellingen signalering receptoren met inbegrip van de aryl koolwaterstof receptor (AHR) en het G-eiwit gekoppelde receptor 35 (GPR35)5 ,6. Bij proefdieren, is waterstand in hersenen KYNA gebleken dat schade kunnen toebrengen aan hun cognitieve prestaties in een array van gedrags assays2,7,8,9,10 . Een opkomende hypothese suggereert dat KYNA een integrale rol bij het moduleren van cognitieve functies door de invloed van slaap-waak gedrag11 speelt, dus verder ter ondersteuning van de rol van Astrocyt-afgeleide moleculen bij het moduleren van de neurobiologie van slaap en cognitie12.
Klinisch, waterstand in KYNA gevonden in cerebrospinaal vocht en Postmortem hersenweefsel van patiënten met schizofrenie13,14,15,16, een invaliderende psychiatrische stoornis gekenmerkt door cognitieve beperkingen. Patiënten met schizofrenie worden ook vaak geplaagd door slaapstoornissen die de ziekte17 verergeren kunnen. Het begrip van de rol van KP metabolisme en KYNA bij het moduleren van een relatie tussen slaap en cognitie, met name tussen leren en geheugen, kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor de behandeling van deze slechte resultaten in schizofrenie en andere psychiatrische ziekten.
Een betrouwbare en consistente methode voor het meten van KP metabolieten is belangrijk om ervoor te zorgen dat het onderzoek die uit verschillende instellingen kan worden geïntegreerd in het wetenschappelijk begrip van KP biologie. Op dit moment beschrijven we de methode voor het meten van kynurenine in rat plasma en KYNA in de rat hersenen door krachtige vloeibare chromatografie (HPLC). Het huidige protocol, dat maakt gebruik van een fluorimetrische detectie in aanwezigheid van Zn2 +, werd eerst ontwikkeld door Shibata18 en meer onlangs aangepast en geoptimaliseerd voor het derivatize met 500 mM zink acetaat als het na kolom reagens, waardoor het opsporen van endogene, nanomolar hoeveelheid KYNA in de hersenen-11.
Om te stimuleren de productie van DOVO endogene KYNA zoals beschreven in het huidige protocol, de directe bioprecursor kynurenine intraperitoneally wordt geïnjecteerd (i.p.) bij ratten. In combinatie met biochemische analyses om te bepalen van de mate van KYNA productie, de gevolgen van een kynurenine uitdaging op het hippocampal-afhankelijke geheugen (passieve vermijden paradigma) en het slaap-waak-architectuur (EEG en EMG signalen) is ook onderzochte11. Een combinatie van deze technieken zorgt voor de studie van de biochemische en functionele gevolgen van een kynurenine uitdaging in vivo bij ratten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voor een betrouwbare beoordeling van KYNA in de hersenen na de toediening van een perifere kynurenine is het essentieel om te combineren en interpreteren van biochemische en functionele experimenten. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol waarmee nieuwe gebruikers om te voorzien in doeltreffende methoden voor het meten van het plasma kynurenine en de hersenen KYNA van ratten. De meting van kynurenine in het plasma bevestigd de nauwkeurige injectie en de meting van de metaboliet KYNA bevestigt de DOVO syn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De huidige studie werd gedeeltelijk gefinancierd door de National Institutes of Health (R01 NS102209) en een donatie van de Clare E. Forbes Trust.
Materials
| Wistar rats | Charles River Laboratories | adult male, 250-350 g | |
| L-kynurenine sulfate | Sai Advantium | ||
| ReproSil-Pur C18 column (4 x 150 mm) | Dr. Maisch GmbH | ||
| EZ Clips | Stoelting Co. | 59022 | |
| Mounting materials screws | PlasticsOne | 00-96 X 1/16 | |
| Nonabsorbable Sutures | MedRep Express | 699B | CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12 |
| Absorbable Sutures | Ethicon | J310H | 4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1 |
| Dental Cement | Stoelting Co. | 51458 | |
| Drill Bit | Stoelting Co. | 514551 | 0.45 mm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alliance HPLC system | |||
| E2695 separation module | Waters | 176269503 | |
| 2475 fluorescence detector | Waters | 186247500 | |
| post-column reagent manager | Waters | 725000556 | |
| Lenovo computer | Waters | 668000249 | |
| Empower software | Waters | 176706100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Passive avoidance box for rat | |||
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | MedAssociates | ENV-018MD | Interior: 22"W x 22"H x 16"D |
| Center channel modulator shuttle box chamber | MedAssociates | ENV-010MC | |
| Stainless steel grid floor for rat | MedAssociates | ENV-010MB-GF | |
| Auto guillotine door | MedAssociates | ENV-010B-S | |
| Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat | MedAssociates | ENV-010MB-QD | |
| Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel | MedAssociates | ENV-221M | |
| Sonalert module with volume control for rat chamber | MedAssociates | ENV-223AM | |
| SmartCtrl 8 input/16 output package | MedAssociates | DIG-716P2 | |
| 8 Channel IR control for shuttle boxes | MedAssociates | ENV-253C | |
| Infrared source and dectector array strips | MedAssociates | ENV-256 | |
| Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080C | |
| Dual range constant current aversive stimulation module | MedAssociates | ENV-410B | |
| Solid state grid floor scrambler module | MedAssociates | ENV-412 | |
| Dual A/B shock control module | MedAssociates | ENV-415 | |
| 2' 3-Pin mini-molex extension | MedAssociates | SG-216A-2 | |
| 10' Shock output cable, DB-9 M/F | MedAssociates | SG-219G-10 | |
| Shuttle shock control cable 15', 6 | MedAssociates | SG-219SA | |
| Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080D | |
| PCI interface package | MedAssociates | DIG-700P2-R2 | |
| Shuttle box avoidance utility package | MedAssociates | SOF-700RA-7 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sleep-Wake Monitoring Equipment | |||
| Ponehmah software | Data Sciences International (DSI) | PNP-P3P-610 | |
| MX2 8 Source Acquisition interface | Data Sciences International (DSI) | PNM-P3P-MX204 | |
| Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit | Data Sciences International (DSI) | 271-0112-013 | |
| Dell 19" computer monitor | Data Sciences International (DSI) | 271-0113-001 | |
| Receivers for plastic cages, 8x | Data Sciences International (DSI) | 272-6001-001 | |
| Cisco RV130 VPN router | Data Sciences International (DSI) | RV130 | |
| Matrix 2.0 | Data Sciences International (DSI) | 271-0119-001 | |
| Network switch | Data Sciences International (DSI) | SG200-08P | |
| Neuroscore software | Data Sciences International (DSI) | 271-0171-CFG | |
| Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET | Data Sciences International (DSI) | 270-0134-001 |
References
- Leklem, J. E. Quantitative aspects of tryptophan metabolism in humans and other species: a review. The American Journal of Clinical Nutrition. 24 (6), 659-672 (1971).
- Pocivavsek, A., Notarangelo, F. M., Wu, H. Q., Bruno, J. P., Schwarcz, R., Pletnikov, M. V., Waddington, J. L. Astrocytes as Pharmacological Targets in the Treatment of Schizophrenia: Focus on Kynurenic Acid. Modeling the Psychophathological Dimensions of Schizophrenia – From Molecules to Behavior. , 423-443 (2016).
- Hilmas, C., et al. The brain metabolite kynurenic acid inhibits alpha7 nicotinic receptor activity and increases non-alpha7 nicotinic receptor expression: physiopathological implications. Journal of Neuroscience. 21 (19), 7463-7473 (2001).
- Perkins, M. N., Stone, T. W. An iontophoretic investigation of the actions of convulsant kynurenines and their interaction with the endogenous excitant quinolinic acid. Brain Research. 247 (1), 184-187 (1982).
- DiNatale, B. C., et al. Kynurenic acid is a potent endogenous aryl hydrocarbon receptor ligand that synergistically induces interleukin-6 in the presence of inflammatory signaling. Toxicological Sciences. 115 (1), 89-97 (2010).
- Wang, J., et al. Kynurenic acid as a ligand for orphan G protein-coupled receptor GPR35. The Journal of Biological Chemistry. 281 (31), 22021-22028 (2006).
- Alexander, K. S., Wu, H. Q., Schwarcz, R., Bruno, J. P. Acute elevations of brain kynurenic acid impair cognitive flexibility: normalization by the alpha7 positive modulator galantamine. Psychopharmacology (Berlin). 220 (3), 627-637 (2012).
- Chess, A. C., Landers, A. M., Bucci, D. J. L-kynurenine treatment alters contextual fear conditioning and context discrimination but not cue-specific fear conditioning. Behavioural Brain Research. 201 (2), 325-331 (2009).
- Chess, A. C., Simoni, M. K., Alling, T. E., Bucci, D. J. Elevations of endogenous kynurenic acid produce spatial working memory deficits. Schizophrenia Bulletin. 33 (3), 797-804 (2007).
- Pocivavsek, A., et al. Fluctuations in endogenous kynurenic acid control hippocampal glutamate and memory. Neuropsychopharmacology. 36 (11), 2357-2367 (2011).
- Pocivavsek, A., Baratta, A. M., Mong, J. A., Viechweg, S. S. Acute Kynurenine Challenge Disrupts Sleep-Wake Architecture and Impairs Contextual Memory in Adult Rats. Sleep. 40 (11), (2017).
- Halassa, M. M., et al. Astrocytic modulation of sleep homeostasis and cognitive consequences of sleep loss. Neuron. 61 (2), 213-219 (2009).
- Erhardt, S., et al. Kynurenic acid levels are elevated in the cerebrospinal fluid of patients with schizophrenia. Neuroscience Letters. 313 (1-2), 96-98 (2001).
- Linderholm, K. R., et al. Increased levels of kynurenine and kynurenic acid in the CSF of patients with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 38 (3), 426-432 (2012).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Impaired kynurenine pathway metabolism in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 37 (6), 1147-1156 (2011).
- Schwarcz, R., et al. Increased cortical kynurenate content in schizophrenia. Biological Psychiatry. 50 (7), 521-530 (2001).
- Pocivavsek, A., Rowland, L. M. Basic Neuroscience Illuminates Causal Relationship Between Sleep and Memory: Translating to Schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 44 (1), 7-14 (2018).
- Shibata, K. Fluorimetric micro-determination of kynurenic acid, an endogenous blocker of neurotoxicity, by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography. 430 (2), 376-380 (1988).
- Buzsaki, G. Memory consolidation during sleep: a neurophysiological perspective. Journal of Sleep Research. 7, 17-23 (1998).
- Graves, L. A., Heller, E. A., Pack, A. I., Abel, T. Sleep deprivation selectively impairs memory consolidation for contextual fear conditioning. Learning & Memory. 10 (3), 168-176 (2003).
- Yamashita, M., Yamamoto, T. Tryptophan circuit in fatigue: From blood to brain and cognition. Brain Research. 1675, 116-126 (2017).
