Base de placa de cultivo a gran escala de elegans de Caenorhabditis: preparación de muestras para el estudio de alteraciones metabólicas en la Diabetes
Summary
Este protocolo describe un método para el cultivo a gran escala de Caenorhabditis elegans en medios sólidos. Como alternativa a la cultura líquida, este protocolo permite la obtención de parámetros de diferentes escalas basadas en la placa de cultivo. Esto incrementa la comparabilidad de los resultados, omitiendo las diferencias morfológicas y metabólicas entre la cultura de los medios líquidos y sólidos.
Abstract
Cultivo de Caenorhabditis elegans (C. elegans) de manera a gran escala en placas de agar puede ser desperdiciador de tiempo y difícil. Este protocolo describe un método sencillo y económico para obtener un gran número de animales para el aislamiento de proteínas para proceder con una mancha blanca /negra occidental, espectrometría de masas o análisis de proteómica más. Además, un aumento del número de nematodos para immunostainings y la integración de múltiples análisis en las mismas condiciones de cultivo pueden fácilmente lograrse. Además, se facilita una transferencia entre placas con diferentes condiciones experimentales. Técnicas comunes en la cultura de la placa implican a la transferencia de un solo C. elegans mediante un alambre de platino y la transferencia de agar poblada trozos con un bisturí. Sin embargo, con el aumento del número de nematodos, estas técnicas se convierten en demasiado tiempo. Este protocolo describe el cultivo a gran escala de C. elegans incluyendo numerosas medidas para minimizar el impacto de la preparación de la muestra sobre la fisiología de la lombriz. Líquido y la tensión de esquileo pueden alterar la duración de los procesos metabólicos en C. elegans, así requiriendo una descripción detallada de los pasos críticos para obtener resultados confiables y reproducibles. C. elegans es un organismo modelo, consistiendo en las células neuronales hasta la tercera, pero carece de vasos sanguíneos, proporcionando así la posibilidad de investigar únicamente neuronales alteraciones independientes de control vascular. Recientemente, neurodegeneración precoz en la retinopatía diabética fue encontrada antes de alteraciones vasculares. Así, C. elegans es de especial interés para el estudio de los mecanismos generales de las complicaciones diabéticas. Por ejemplo, una formación creciente de había avanzada glicación final (edades) y especies reactivas del oxígeno (ROS) se observaron, que se encuentran reproducible en C. elegans. Protocolos para manejar las muestras de tamaño adecuado para un espectro más amplio de investigaciones se presentan aquí, ejemplificado por el estudio de la diabetes inducida por alteraciones bioquímicas. En general, este protocolo puede ser útil para estudios que requieren gran C. elegans números y en que cultivos líquidos no es conveniente.
Introduction
Análisis de proteína, como un western blot o espectrometría de masas, requieren miligramos de proteína. Esta producción requiere de un cultivo a gran escala de cientos de C. elegans, que se pueden lograr cultivos líquidos o en medios sólidos transferencia de los nematodos por lavado. Líquido y la tensión de esquileo induce la expresión de canales de sodio epitelial (ENaC), que puede aumentar el estrés osmótico a través de una mayor absorción de sodio, potencialmente alterar la vida de C. elegans y afectar los análisis metabólicos1 . Por lo tanto, algunos pasos críticos en este protocolo para el enfoque basado en la placa toman la reducción de estrés que afectan a la variabilidad experimental en cuenta. Cultivo líquido, por otro lado, influye en el fenotipo de los nematodos y complica la cultura y la colección de un número exacto de nematodos2. Por otra parte, sustancias reactivas pueden modificarse por los componentes de los medios de comunicación y pueden distribuir irregularmente antes de llegar a los nematodos. Con respecto a las limitaciones de cultivo líquido, este protocolo proporciona un acercamiento alternativo al cultivo de las muestras a gran escala de C. elegans.
C. elegans es un organismo modelo con una red distinta de 302 células neuronales, que constituyen un tercio de sus células3. Desde su introducción en la ciencia, muchos homólogos y orthologous genes se han descrito, amplificando su valor como modelo para la investigación médica. Recientemente, se han presentado pruebas de deterioro neurológico en la retinopatía diabética, anterior a daño vascular,4. C. elegans carece de vasos sanguíneos, pero contiene una red neuronal distinta, lo que es un modelo conveniente para investigar alteraciones neuronales además de vascular. Así, C. elegans es de especial interés para el estudio de los mecanismos generales de las complicaciones diabéticas. Alteraciones bioquímicas en las complicaciones diabéticas implican la formación de las edades, que más influyen en la formación de ROS en respuesta a la hiperglucemia5. Las edades se encuentran en C. elegans y contribuyen al daño neuronal6. Enfermedades crónicas son causadas a menudo por procesos complejo, poligénicos, que requieren un enfoque multiparamétrico para la evaluación de sus mecanismos subyacentes, ejemplificado aquí con la evaluación de las complicaciones diabéticas. Este protocolo puede ser de utilidad para la obtención de múltiples parámetros simultáneamente, así como posteriormente. Se logra mayor comparabilidad y reproducibilidad de un enfoque multiparamétrico omitiendo las diferencias morfológicas y metabólicas entre la cultura de los medios líquidos y sólidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo presenta un enfoque fiable para el cultivo a gran escala de C. elegans para obtener resultados cuantitativos. Los hallazgos de la literatura podrían repetirse tal como se muestra en los Resultados de representante. Aunque este protocolo para la recogida de muestras a gran escala de C. elegans parece un método sencillo, hay algunos riesgos a tener en cuenta. Con respecto a la sincronización de la población de nematodos, este protocolo describe un acercamiento por blanq…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dentro de la CIG 1874 “Complicaciones microvasculares de la diabetes” y CRC 1118 “Metabolitos reactivos como causa de las complicaciones tardías diabéticas”. Las cepas de C. elegans N2 y CL2166 fueron proporcionadas por la CGC, que está financiada por la oficina de NIH de investigación programas de infraestructura (P40 OD010440).
Materials
| E. coli OP50 | CGC | n/a | |
| C. elegans N2 | CGC | n/a | |
| C. elegans CL2166 | CGC | n/a | |
| Petri dish, 60 x 15 mm | Greiner One | 628161 | |
| Volumetric pipet, glas, 10 mL | Neolab | E-0413 | |
| Proteinase inhibitor cocktail tablets | Roche | 04693124001 | |
| Non-denaturing lysate buffer: | |||
| Tris-HCl, pH 8 | Sigma | T3253 | |
| Sodiumchloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5391 | |
| 96-well plates, transparent bottom | Brand | 781611 | |
| Infinite M200, plate reader | Tecan | 30017581 | |
| Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm | Next advance | ZROB05-RNA | |
| Bullet Blender, homogenizer | Next advance | BBX24 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P6887 | |
| Thymol | Sigma | T0501 | |
| Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P6911 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P43339 | |
| Prolidase from Porcine Kidney | Sigma | P6675 | |
| Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica | Sigma | A8200 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merckmillipore | UFC501096 | |
| Basic Materials for plate culture are described in Reference 6. |
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