מבוסס על צלחת Large-scale טיפוח Caenorhabditis elegans: הכנת הדוגמא על המחקר של שינויים מטבוליים בחולי סוכרת
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לגידול בקנה מידה גדול Caenorhabditis elegans במדיה מוצק. כחלופה תרבית נוזלית, פרוטוקול זה מאפשר קבלת הפרמטרים של סולמות שונים המעובדים המבוסס על צלחת. פעולה זו מגדילה את comparability של תוצאות על-ידי השמטת את ההבדלים מטבולית מורפולוגיים בין תרבות המדיה נוזלי ומוצק.
Abstract
Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) בצורה רחבת היקף על פלטות אגר ניתן ולהקשות. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וזולה כדי לקבל מספר גדול של חיות בשביל הבידוד של חלבונים כדי להמשיך עם אבן חשופה המערבי, ספקטרומטר מסה או ניתוחים פרוטאומיקס נוספות. יתר על כן, עלייה של מספרי נמטודות immunostainings ושילוב של מספר ניתוחים בתנאים culturing אותו בקלות ניתן להשיג. בנוסף, העברה בין לוחות עם תנאים שונים ניסיוני הוא הקל. טכניקות נפוצות בתרבות צלחת לכלול ההעברה של יחיד C. elegans באמצעות חוט פלטינה וגושים בהעברת אגר מיושבים באמצעות אזמל. עם זאת, עם הגדלת מספרים נמטודות, טכניקות אלו הופכים זמן רב יתר על המידה. פרוטוקול זה מתאר את התרבות בקנה מידה גדול של C. elegans כולל מדרגות רבות כדי למזער את ההשפעה של הכנת הדוגמא על הפיזיולוגיה של התולעת. נוזל לבין מאמץ גזירה יכול לשנות את תוחלת החיים של ואת התהליכים המטאבוליים C. elegans, וכך מצריכים תיאור מפורט של השלבים הקריטיים כדי לאחזר תוצאות אמין לשחזור. C. elegans הוא אורגניזם מודל, המורכב תאים עצביים עבור עד שליש, אבל חסר כלי הדם, ובכך מספק את האפשרות לחקור אך ורק שינויים עצביים עצמאית של שליטה בכלי הדם. לאחרונה, הקשורים ניוון מוחיים מוקדם ב רטינופתיה סוכרתית נמצאה לפני שינויים בכלי הדם. לכן, C. elegans הוא עניין מיוחד לימוד מנגנונים כלליים של סיבוכים סוכרתית. לדוגמה, מערך מוגברת של מתקדמת glycation end מוצרים (גילאי), מינים חמצן תגובתי (ROS) נצפית, אשר נמצאים reproducibly C. elegans. פרוטוקולים לטפל בדגימות של גודל מספקת קשת רחבה של חקירות מוצגים כאן, ומעוררות את המחקר של סוכרת-induced שינויים ביוכימיים. באופן כללי, פרוטוקול זה יכול להיות שימושי עבור מחקרים הדורשים גדולה C. elegans מספרים ב תרבות נוזלי אשר אינה מתאימה.
Introduction
ניתוחים חלבון, כגון תספיג או ספקטרומטר מסה, דורשים מיליגרם של חלבון. תשואה זו דורשת culturing בקנה מידה גדול של מאות C. elegans, אשר ניתן לבצע על-ידי תרבית נוזלית או במדיה מוצק נמטודות את מעבירה על ידי שטיפה. נוזל לבין מאמץ גזירה המניע את הביטוי של תעלות נתרן אפיתל (ENaC), אשר יכול להגביר את הלחץ osmotic באמצעות ספיגה מוגברת של נתרן, פוטנציאל לשנות את תוחלת החיים של C. elegans , המשפיעים על חילוף החומרים ניתוחים1 . לכן, כמה צעדים קריטיים פרוטוקול זה הגישה המבוססת על הצלחת לקחת והורדת המתח משפיע על השתנות ניסיוני בחשבון. תרבית נוזלית, מצד שני, השפעות של פנוטיפ של נמטודות, מסבך את התרבות ואת אוסף של מספר מדויק של נמטודות2. יתר על כן, תגובתי חומרים יכולים להשתנות על-ידי רכיבי מדיה ולהפיץ ייתכן לצר לפני הגיעם של נמטודות. לגבי המגבלות של תרבית נוזלית, פרוטוקול זה מספק גישה חלופית culturing דוגמאות בקנה מידה גדול של C. elegans.
C. elegans הוא אורגניזם מודל עם רשת נפרדים של תאים עצביים 302, ממציא שליש כל שלה תאים3. מאז השקתו בקטע של מדעים, רבים הומולוגי orthologous הגנים היו כמתואר לעיל, הגברה ערכו כמודל למחקר רפואי. לאחרונה, ראיות לקות נוירולוגית ב רטינופתיה סוכרתית, שקדמו נזק בכלי הדם, הוצגו4. C. elegans חסר כלי הדם, אך מכילה רשת עצביים שונים, שהופך אותו מודל מתאים לחקור שינויים עצביים מלבד אלה כלי הדם. לכן, C. elegans הוא עניין מיוחד לימוד מנגנונים כלליים של סיבוכים סוכרתית. שינויים ביוכימיים סיבוכים סוכרתית לערב את היווצרות הגילאים, אשר בהמשך להשפיע על היווצרות של ROS בתגובה היפרגליקמיה5. הגילאים נמצאים C . elegans ולתרום נזקים עצביים6. מחלות כרוניות לעיתים קרובות נגרמות על ידי תהליכים מורכבים, בקשתית הדורשות גישה multiparametric להערכה של מנגנונים הבסיסית שלהם, כפי שהודגם כאן עם הצהרתו של סיבוכים סוכרתית. פרוטוקול זה ניתן לשימוש להשגת פרמטרים מרובים בו זמנית, כמו גם לאחר מכן. Comparability מוגברת, הפארמצבטית בגישה multiparametric יכולה להיות מושגת על-ידי השמטת את ההבדלים מטבולית מורפולוגיים בין תרבות המדיה נוזלי ומוצק.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מציג גישה אמין עבור culturing בקנה מידה גדול של C. elegans כדי להשיג תוצאות כמותיות. ממצאים מתוך הספרות יכול לשכפל כמוצג בתיבה על התוצאות נציג. אף-על-פי פרוטוקול זה עבור האוסף של דוגמאות בקנה מידה גדול של C. elegans נראה שיטה ישר קדימה, ישנם החסרונות בטוח לקחת בחשבון. לגבי ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי דויטשה פתוח (DFG) בתוך 1874 IRTG “סיבוכים microvascular סוכרתית” CRC 1118 “תגובתי מטבוליטים כגורם סוכרתית סיבוכים מאוחר”. זנים של C. elegans N2 ו CL2166 נמסרו בידי CGC, אשר ממומן על ידי המשרד NIH של תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440).
Materials
| E. coli OP50 | CGC | n/a | |
| C. elegans N2 | CGC | n/a | |
| C. elegans CL2166 | CGC | n/a | |
| Petri dish, 60 x 15 mm | Greiner One | 628161 | |
| Volumetric pipet, glas, 10 mL | Neolab | E-0413 | |
| Proteinase inhibitor cocktail tablets | Roche | 04693124001 | |
| Non-denaturing lysate buffer: | |||
| Tris-HCl, pH 8 | Sigma | T3253 | |
| Sodiumchloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5391 | |
| 96-well plates, transparent bottom | Brand | 781611 | |
| Infinite M200, plate reader | Tecan | 30017581 | |
| Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm | Next advance | ZROB05-RNA | |
| Bullet Blender, homogenizer | Next advance | BBX24 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P6887 | |
| Thymol | Sigma | T0501 | |
| Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P6911 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P43339 | |
| Prolidase from Porcine Kidney | Sigma | P6675 | |
| Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica | Sigma | A8200 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merckmillipore | UFC501096 | |
| Basic Materials for plate culture are described in Reference 6. |
References
- Fronius, M., Clauss, W. G. Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you. Pflügers Archiv. 455 (5), 775-785 (2008).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Sohn, E. H., et al. Retinal neurodegeneration may precede microvascular changes characteristic of diabetic retinopathy in diabetes mellitus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (19), E2655-E2664 (2016).
- Chilelli, N. C., Burlina, S., Lapolla, A. AGEs, rather than hyperglycemia, are responsible for microvascular complications in diabetes: a "glycoxidation-centric" point of view. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases. 23 (10), 913-919 (2013).
- Schlotterer, A., et al. C. elegans as model for the study of high glucose- mediated life span reduction. Diabetes. 58 (11), 2450-2456 (2009).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Leiers, B., et al. A stress-responsive glutathione S-transferase confers resistance to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 34 (11), 1405-1415 (2003).
- Rabbani, N., Thornalley, P. J. Measurement of methylglyoxal by stable isotopic dilution analysis LC-MS/MS with corroborative prediction in physiological samples. Nature Protocols. 9 (8), 1969-1979 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 7 (72), 248-254 (1976).
- Ahmed, N., Argirov, O. K., Minhas, H. S., Cordeiro, C. A., Thornalley, P. J. Assay of advanced glycation endproducts (AGEs): surveying AGEs by chromatographic assay with derivatization by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate and application to Nepsilon-carboxymethyl-lysine- and Nepsilon-(1-carboxyethyl)lysine-modified albumin. Biochemical Journal. 364 (Pt 1), 1-14 (2002).
- Thornalley, P. J., et al. Quantitative screening of advanced glycation endproducts in cellular and extracellular proteins by tandem mass spectrometry. Biochemical Journal. 375 (Pt 3), 581-592 (2003).
- Karachalias, N., Babaei-Jadidi, R., Ahmed, N., Thornalley, P. Accumulation of fructosyllysine and advanced glycation end products in the kidney, retina and peripheral nerve of streptozotocin-induced diabetic rats. Biochemical Society Transactions. 31, 1423-1425 (2003).
- Morcos, M., et al. Glyoxalase-1 prevents mitochondrial protein modification and enhances lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 7 (2), 260-269 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lagido, C., McLaggan, D., Glover, L. A. A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (105), e53083 (2015).
- Takamiya, S., Mita, T. Large-scale purification of active liquid-cultured Caenorhabditis elegans using a modified Baermann apparatus. Parasitology International. 65 (5 Pt B), 580-583 (2016).
- Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic systems for high-throughput and high-content screening using the nematode Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 17 (22), 3736-3759 (2017).
- Zhu, G., Yin, F., Wang, L., Wei, W., Jiang, L., Qin, J. Modeling type 2 diabetes-like hyperglycemia in C. elegans on a microdevice. Integrative Biology. 8 (1), 30-38 (2016).
