Plaat gebaseerde grootschalige teelt van Caenorhabditis elegans: bereiding van de monsters voor de studie van de metabole veranderingen bij Diabetes
Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor de grootschalige teelt van Caenorhabditis elegans op solide media. Als alternatief voor vloeibare cultuur kunnen dit protocol verkrijgen van parameters voor verschillende schalen onder plaat gebaseerde teelt. Dit verhoogt de vergelijkbaarheid van de resultaten door het weglaten van de morfologische en metabole verschillen tussen vloeibare en vaste mediacultuur.
Abstract
Kweken van Caenorhabditis elegans (C. elegans) in een grootschalige manier op agar platen kunnen tijdrovend en moeilijk zijn. Dit protocol beschrijft een eenvoudige en goedkope methode voor het verkrijgen van een groot aantal dieren voor de isolatie van proteïnen om door te gaan met een westelijke vlek, massaspectrometrie of verdere proteomics analyses. Een stijging van de nematode nummers voor immunostainings en de integratie van meerdere analyses onder dezelfde voorwaarden kweken kunnen bovendien gemakkelijk worden bereikt. Bovendien is een overdracht tussen platen met verschillende experimentele omstandigheden wordt vergemakkelijkt. Gebruikte technieken in plaat cultuur de overdracht van een enkele C. elegans met behulp van een platina-draad en de overdracht van bevolkte agar brokken met behulp van een scalpel. Met de toenemende nematode nummers, worden deze technieken echter overdreven tijdrovend. Dit protocol beschrijft de grootschalige cultuur van C. elegans met inbegrip van talrijke stappen om te minimaliseren van de impact van de bereiding van de monsters op de Fysiologie van de worm. Vloeistof en shear stress kunnen de levensduur van en metabole processen in C. elegans, waarvoor derhalve een gedetailleerde beschrijving van de kritische stappen om op te halen van betrouwbare en reproduceerbare resultaten wijzigen. C. elegans is een modelorganisme, bestaande uit de neuronale cellen voor maximaal een derde, maar bij gebrek aan bloedvaten, waardoor de mogelijkheid te onderzoeken van uitsluitend neuronale wijzigingen onafhankelijk van vasculaire controle. Vroege neurodegeneratie in diabetische retinopathie bleek onlangs, voorafgaand aan vasculaire wijzigingen. C. elegans is dus van bijzonder belang zijn voor de studie van de algemene mechanismen voor diabetische complicaties. Bijvoorbeeld, een verhoogde vorming van advanced glycation eindproducten (leeftijden) en reactieve zuurstof soorten (ROS) is waargenomen, die reproducibly worden aangetroffen in C. elegans. Protocollen bij het behandelen van monsters van voldoende grootte voor een breder spectrum van de onderzoeken worden hier gepresenteerd wordt geïllustreerd door de studie van diabetes-veroorzaakte biochemische veranderingen. In het algemeen, dit protocol nuttig kan zijn voor studies die vereisen grote C. elegans getallen en in welke vloeibare cultuur niet geschikt is.
Introduction
Eiwit analyses, zoals een westelijke vlek of massaspectrometrie, vereisen milligram van eiwit. Deze opbrengst vereist een grote schaal kweken van honderden C. elegans, die kan worden bereikt door vloeibare cultuur of op solide media overzetten van de nematoden door wassen. Vloeistof en schuifspanning induceert de expressie van epitheliale natrium kanalen (ENaC), die zou kunnen de osmotische stress door middel van een verhoogde opname van natrium vergroten, potentieel veranderen de levensduur van C. elegans en beïnvloeden van metabole analyses1 . Daarom nemen sommige kritische stappen in dit protocol voor de plaat gebaseerde benadering de vermindering van stress op het gebied van experimentele variabiliteit in aanmerking. Vloeibare cultuur, aan de andere kant, van invloed op het fenotype van de nematoden en bemoeilijkt de cultuur en collectie van een exact aantal aaltjes2. Bovendien, reactieve stoffen kunnen worden gewijzigd door de media-onderdelen en ongelijk kunnen verdelen alvorens de nematoden. Met betrekking tot de beperkingen van vloeibare cultuur biedt dit protocol een alternatieve aanpak voor het kweken van grootschalige monsters van C. elegans.
C. elegans is een model-organisme met een verschillend netwerk van 302 neuronale cellen, die deel uitmaken van een derde van alle haar cellen3. Sinds de invoering ervan in wetenschap, veel homologe en orthologous genen zijn beschreven, zijn waarde als een model voor medisch onderzoek sturen. Onlangs, bewijs voor neurologische stoornis in diabetische retinopathie, voorafgaand aan vasculaire schade, heeft ingediend4. C. elegans ontbreekt bloedvaten, maar bevat een verschillende neuronale netwerk, waardoor het een geschikt model te onderzoeken van neuronale wijzigingen afgezien van vasculaire ones. C. elegans is dus van bijzonder belang zijn voor de studie van de algemene mechanismen voor diabetische complicaties. Biochemische wijzigingen in diabetische complicaties betrekking hebben op de vorming van AGEs, die verder de vorming van ROS in reactie op hyperglycemie5 beïnvloeden. Leeftijden zijn te vinden in C. elegans en bijdragen tot de neuronale schade6. Chronische ziekten worden vaak veroorzaakt door complexe, polygeen processen, die een multiparametric aanpak vereisen voor de beoordeling van hun onderliggende mechanismen, zoals hier wordt geïllustreerd met de beoordeling van diabetische complicaties. Dit protocol kan worden gebruikt voor het verkrijgen van meerdere parameters tegelijk, en vervolgens. Meer vergelijkbaarheid en reproduceerbaarheid van een multiparametric benadering kunnen worden bereikt door het weglaten van de morfologische en metabole verschillen tussen vloeibare en vaste mediacultuur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol biedt een betrouwbare benadering voor het grootschalig kweken van C. elegans om kwantitatieve resultaten te verkrijgen. Bevindingen uit de literatuur kunnen worden gerepliceerd, zoals wordt weergegeven in de Resultaten van de vertegenwoordiger. Hoewel dit protocol voor grootschalige monsters van C. elegans een rechttoe-rechtaan-methode lijkt, zijn er bepaalde valkuilen rekening te houden. Met betrekking tot de synchronisatie van de nematode bevolking beschrijft dit protocol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) binnen de IRTG 1874 “Diabetische microvasculaire complicaties” en CRC 1118 “Reactieve metabolieten als een reden tot diabetische late complicaties”. C. elegans stammen N2 en CL2166 werden verstrekt door de CGC, die wordt gefinancierd door het Bureau van de NIH onderzoek infrastructuur programma’s (P40 OD010440).
Materials
| E. coli OP50 | CGC | n/a | |
| C. elegans N2 | CGC | n/a | |
| C. elegans CL2166 | CGC | n/a | |
| Petri dish, 60 x 15 mm | Greiner One | 628161 | |
| Volumetric pipet, glas, 10 mL | Neolab | E-0413 | |
| Proteinase inhibitor cocktail tablets | Roche | 04693124001 | |
| Non-denaturing lysate buffer: | |||
| Tris-HCl, pH 8 | Sigma | T3253 | |
| Sodiumchloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5391 | |
| 96-well plates, transparent bottom | Brand | 781611 | |
| Infinite M200, plate reader | Tecan | 30017581 | |
| Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm | Next advance | ZROB05-RNA | |
| Bullet Blender, homogenizer | Next advance | BBX24 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P6887 | |
| Thymol | Sigma | T0501 | |
| Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P6911 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P43339 | |
| Prolidase from Porcine Kidney | Sigma | P6675 | |
| Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica | Sigma | A8200 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merckmillipore | UFC501096 | |
| Basic Materials for plate culture are described in Reference 6. |
References
- Fronius, M., Clauss, W. G. Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you. Pflügers Archiv. 455 (5), 775-785 (2008).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Sohn, E. H., et al. Retinal neurodegeneration may precede microvascular changes characteristic of diabetic retinopathy in diabetes mellitus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (19), E2655-E2664 (2016).
- Chilelli, N. C., Burlina, S., Lapolla, A. AGEs, rather than hyperglycemia, are responsible for microvascular complications in diabetes: a "glycoxidation-centric" point of view. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases. 23 (10), 913-919 (2013).
- Schlotterer, A., et al. C. elegans as model for the study of high glucose- mediated life span reduction. Diabetes. 58 (11), 2450-2456 (2009).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Leiers, B., et al. A stress-responsive glutathione S-transferase confers resistance to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 34 (11), 1405-1415 (2003).
- Rabbani, N., Thornalley, P. J. Measurement of methylglyoxal by stable isotopic dilution analysis LC-MS/MS with corroborative prediction in physiological samples. Nature Protocols. 9 (8), 1969-1979 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 7 (72), 248-254 (1976).
- Ahmed, N., Argirov, O. K., Minhas, H. S., Cordeiro, C. A., Thornalley, P. J. Assay of advanced glycation endproducts (AGEs): surveying AGEs by chromatographic assay with derivatization by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate and application to Nepsilon-carboxymethyl-lysine- and Nepsilon-(1-carboxyethyl)lysine-modified albumin. Biochemical Journal. 364 (Pt 1), 1-14 (2002).
- Thornalley, P. J., et al. Quantitative screening of advanced glycation endproducts in cellular and extracellular proteins by tandem mass spectrometry. Biochemical Journal. 375 (Pt 3), 581-592 (2003).
- Karachalias, N., Babaei-Jadidi, R., Ahmed, N., Thornalley, P. Accumulation of fructosyllysine and advanced glycation end products in the kidney, retina and peripheral nerve of streptozotocin-induced diabetic rats. Biochemical Society Transactions. 31, 1423-1425 (2003).
- Morcos, M., et al. Glyoxalase-1 prevents mitochondrial protein modification and enhances lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 7 (2), 260-269 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lagido, C., McLaggan, D., Glover, L. A. A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (105), e53083 (2015).
- Takamiya, S., Mita, T. Large-scale purification of active liquid-cultured Caenorhabditis elegans using a modified Baermann apparatus. Parasitology International. 65 (5 Pt B), 580-583 (2016).
- Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic systems for high-throughput and high-content screening using the nematode Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 17 (22), 3736-3759 (2017).
- Zhu, G., Yin, F., Wang, L., Wei, W., Jiang, L., Qin, J. Modeling type 2 diabetes-like hyperglycemia in C. elegans on a microdevice. Integrative Biology. 8 (1), 30-38 (2016).
