زراعة الواسعة النطاق على أساس لوحة ايليجانس كاينورهابديتيس: "إعداد نموذج" "دراسة التعديلات الأيضي" في مرض السكري
Summary
هذا البروتوكول وصف أسلوب لزراعة ايليجانس كاينورهابديتيس على نطاق واسع في وسائل الإعلام الصلبة. كبديل لثقافة السائل، يسمح هذا البروتوكول الحصول على معلمات جداول مختلفة المزروعة المستندة إلى اللوحة. وهذا يزيد من قابلية النتائج للمقارنة بإهمال الاختلافات المورفولوجية والأيضية بين ثقافة وسائل الإعلام السائلة والصلبة.
Abstract
ويمكن استزراع ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) بصورة واسعة النطاق على لوحات أجار تستغرق وقتاً طويلاً وصعبا. ويصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وغير مكلفة للحصول على عدد كبير من الحيوانات لعزل البروتينات المضي قدما مع وصمة عار غربية أو الكتلي، أو كذلك البروتيوميات التحليلات. وعلاوة على ذلك، زيادة إعداد السلكية إيمونوستينينجس، وإدماج التحليلات متعددة نفس الظروف تثقيف يمكن بسهولة تحقيق. بالإضافة إلى ذلك، مما يسهل نقل بين لوحات مع ظروف تجريبية مختلفة. التقنيات الشائعة في لوحة الثقافة تنطوي على نقل واحد C. ايليجانس استخدام سلك البلاتين وقطع نقل أجار المأهولة بالسكان باستخدام مشرط. ومع ذلك، مع تزايد إعداد السلكية، تصبح هذه التقنيات تستغرق وقتاً طويلاً أكثر من اللازم. ويصف هذا البروتوكول ثقافة ايليجانس جيم- بما في ذلك خطوات عديدة التقليل من تأثير إعداد عينة على الفسيولوجيا الدودة على نطاق واسع. يمكن تغيير السوائل وإجهاد القص عمر وعمليات الأيض في C. ايليجانس، مما يتطلب وصفاً مفصلاً للخطوات الحاسمة من أجل استرداد نتائج موثوقة واستنساخه. C. ايليجانس كائن نموذج، تتكون من الخلايا العصبية لتصل إلى الثلث، ولكن تفتقر إلى الأوعية الدموية، مما يوفر إمكانية للتحقيق المستقلة لمراقبة الأوعية الدموية العصبية التعديلات فقط. في الآونة الأخيرة، تم العثور على نيوروديجينيريشن المبكر في اعتلال الشبكية السكري قبل التعديلات والأوعية الدموية. وهكذا، C. ايليجانس اهتماما خاصا لدراسة الآليات العامة لمضاعفات السكري. على سبيل المثال، زيادة تشكيل متقدمة glycation المنتجات النهائية (الإعمار) ويلاحظ أنواع الأكسجين التفاعلية (روس)، التي توجد في تكاثر في C. ايليجانس. بروتوكولات لمعالجة العينات ذات حجم كاف لمجموعة أوسع من التحقيقات ترد هنا، يتجلى في دراسة التعديلات البيوكيميائية التي يسببها مرض السكري. بشكل عام، هذا البروتوكول يمكن أن يكون مفيداً للدراسات التي تتطلب كبيرة C. ايليجانس أرقام وفي ثقافة السائل الذي هو غير مناسب.
Introduction
تحليل البروتين، مثل لطخة غربية أو الكتلي، تتطلب ملليغرام من البروتين. ويتطلب هذا العائد استزراع واسعة النطاق لمئات من C. ايليجانس، الذي يمكن أن يتحقق بالثقافة السائلة أو الصلبة وسائل الإعلام نقل للخيطيات قبل الغسيل. السوائل وإجهاد القص الحث على التعبير عن قنوات الصوديوم الظهارية (ايناك)، التي يمكن أن تزيد من الضغط ناضح عن طريق زيادة امتصاص الصوديوم، يحتمل أن يغير عمر C. ايليجانس والتي تؤثر على تحاليل ايضية1 . ولذلك، اتخاذ بعض الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول للنهج القائم على لوحة الحد الإجهاد التي تؤثر على تجريبية تقلب في الاعتبار. ثقافة السائل، من ناحية أخرى، يؤثر على النمط الظاهري للديدان الخيطية ويعقد في الثقافة وجمع عدد الدقيق من الديدان الخيطية2. علاوة على ذلك، يمكن تعديلها من قبل وسائل الإعلام مكونات المواد المتفاعلة ويجوز توزيع غير متساو قبل بلوغ للخيطيات. فيما يتعلق بقيود ثقافة السائل، يوفر هذا البروتوكول نهج بديل لاستزراع عينات واسعة النطاق من C. ايليجانس.
C. ايليجانس كائن نموذج مع شبكة متميزة من الخلايا العصبية 302، يشكلون ثلث جميع الخلايا لها3. منذ إطلاقها في العلم، وكثير مثلى والجينات أورثولوجوس وقد وصف، بتضخيم قيمته كنموذج للبحوث الطبية. في الآونة الأخيرة، ولم تقدم أدلة لضعف العصبية في اعتلال الشبكية السكري، السابقة لتلف الأوعية الدموية،4. C. ايليجانس تفتقر إلى الأوعية الدموية، ولكن يحتوي على شبكة الخلايا العصبية متميزة، مما يجعل من نموذج مناسب للتحقيق التعديلات العصبية وبصرف النظر عن تلك الأوعية الدموية. وهكذا، C. ايليجانس اهتماما خاصا لدراسة الآليات العامة لمضاعفات السكري. وتشمل التعديلات البيوكيميائية في مضاعفات السكري تشكيل الإعمار، وكذلك التأثير على تشكيل روس في الاستجابة لارتفاع السكر في الدم5. وتوجد في C. ايليجانس الإعمار وتسهم في تلف الخلايا العصبية6. وغالباً ما تسبب الأمراض المزمنة بالعمليات المعقدة، جينائي التي تتطلب اتباع نهج مولتيباراميتريك لتقييم تلك الآليات الكامنة، كما يتضح هنا مع تقييم لمضاعفات السكري. هذا البروتوكول يمكن استخدامها للحصول على معلمات متعددة في وقت واحد، وكذلك في وقت لاحق. يمكن زيادة القابلية للمقارنة وإمكانية تكرار نتائج نهج مولتيباراميتريك بإهمال الاختلافات المورفولوجية والأيضية بين ثقافة وسائل الإعلام السائلة والصلبة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويعرض هذا البروتوكول نهج موثوق بها لاستزراع واسعة النطاق من ايليجانس جيم للحصول على النتائج الكمية. يمكن تكرار النتائج المستمدة من الأدب كما هو موضح في نتائج الممثل. على الرغم من أن هذا البروتوكول لجمع العينات على نطاق واسع من C. ايليجانس يبدو وكأنه أسلوب مستقيم إلى الأم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذه الدراسة كانت تدعمها الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG) داخل 1874 إيرتج “مضاعفات microvascular السكري” و 1118 CRC “رد الفعل والايضات كسبب للسكري مضاعفات متأخرة”. وقدمت سلالات C. ايليجانس N2 و CL2166 كجك، الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة “برامج الهياكل الأساسية للبحوث” (P40 OD010440).
Materials
| E. coli OP50 | CGC | n/a | |
| C. elegans N2 | CGC | n/a | |
| C. elegans CL2166 | CGC | n/a | |
| Petri dish, 60 x 15 mm | Greiner One | 628161 | |
| Volumetric pipet, glas, 10 mL | Neolab | E-0413 | |
| Proteinase inhibitor cocktail tablets | Roche | 04693124001 | |
| Non-denaturing lysate buffer: | |||
| Tris-HCl, pH 8 | Sigma | T3253 | |
| Sodiumchloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5391 | |
| 96-well plates, transparent bottom | Brand | 781611 | |
| Infinite M200, plate reader | Tecan | 30017581 | |
| Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm | Next advance | ZROB05-RNA | |
| Bullet Blender, homogenizer | Next advance | BBX24 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P6887 | |
| Thymol | Sigma | T0501 | |
| Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P6911 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P43339 | |
| Prolidase from Porcine Kidney | Sigma | P6675 | |
| Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica | Sigma | A8200 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merckmillipore | UFC501096 | |
| Basic Materials for plate culture are described in Reference 6. |
References
- Fronius, M., Clauss, W. G. Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you. Pflügers Archiv. 455 (5), 775-785 (2008).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Sohn, E. H., et al. Retinal neurodegeneration may precede microvascular changes characteristic of diabetic retinopathy in diabetes mellitus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (19), E2655-E2664 (2016).
- Chilelli, N. C., Burlina, S., Lapolla, A. AGEs, rather than hyperglycemia, are responsible for microvascular complications in diabetes: a "glycoxidation-centric" point of view. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases. 23 (10), 913-919 (2013).
- Schlotterer, A., et al. C. elegans as model for the study of high glucose- mediated life span reduction. Diabetes. 58 (11), 2450-2456 (2009).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Leiers, B., et al. A stress-responsive glutathione S-transferase confers resistance to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 34 (11), 1405-1415 (2003).
- Rabbani, N., Thornalley, P. J. Measurement of methylglyoxal by stable isotopic dilution analysis LC-MS/MS with corroborative prediction in physiological samples. Nature Protocols. 9 (8), 1969-1979 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 7 (72), 248-254 (1976).
- Ahmed, N., Argirov, O. K., Minhas, H. S., Cordeiro, C. A., Thornalley, P. J. Assay of advanced glycation endproducts (AGEs): surveying AGEs by chromatographic assay with derivatization by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate and application to Nepsilon-carboxymethyl-lysine- and Nepsilon-(1-carboxyethyl)lysine-modified albumin. Biochemical Journal. 364 (Pt 1), 1-14 (2002).
- Thornalley, P. J., et al. Quantitative screening of advanced glycation endproducts in cellular and extracellular proteins by tandem mass spectrometry. Biochemical Journal. 375 (Pt 3), 581-592 (2003).
- Karachalias, N., Babaei-Jadidi, R., Ahmed, N., Thornalley, P. Accumulation of fructosyllysine and advanced glycation end products in the kidney, retina and peripheral nerve of streptozotocin-induced diabetic rats. Biochemical Society Transactions. 31, 1423-1425 (2003).
- Morcos, M., et al. Glyoxalase-1 prevents mitochondrial protein modification and enhances lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 7 (2), 260-269 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lagido, C., McLaggan, D., Glover, L. A. A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (105), e53083 (2015).
- Takamiya, S., Mita, T. Large-scale purification of active liquid-cultured Caenorhabditis elegans using a modified Baermann apparatus. Parasitology International. 65 (5 Pt B), 580-583 (2016).
- Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic systems for high-throughput and high-content screening using the nematode Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 17 (22), 3736-3759 (2017).
- Zhu, G., Yin, F., Wang, L., Wei, W., Jiang, L., Qin, J. Modeling type 2 diabetes-like hyperglycemia in C. elegans on a microdevice. Integrative Biology. 8 (1), 30-38 (2016).
