ジカ ウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1^-/-マウスの T 細胞応答の評価

動物実験は、ウイルス性の疾病の予防、中国 CDC 動物介護制度と国立研究所の使用委員会によって承認されました。次の機関動物愛護と動物のプロトコルの利用委員会が承認したすべての実験を行った。 1. ウイルス感染症 続ける大人 (8 週齢に 6) Ifnar1-/- (男性 50%、女性 50%) マウス標準的な特別な病原体フリー (SPF) の条件で、食料や水に定期的にアクセスを許可して。 ZIKV経由で1 × 104フォーカス形成単位 (FFUs) ウイルスを含むリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) バッファーに ZIKV の 100 μ L のレトロな軌道接種と Ifnar1-/-マウスに感染します。同様に、PBS の等量を制御マウスを提供します。注意: ABSL2 の条件の下でマウスを感染し、バイオ セーフティ キャビネットにおけるウイルス感染マウスにこれらの手順を実行します。 15 日間の重量とマウスの臨床症状 (震え、千鳥 3 月、二国間弛緩な後肢) を毎日監視します。 2. ZIKV ワクチン接種 6 と 8 週齢の間 Ifnar1-/- (男性 50%、女性 50%) マウスを使用します。18-29 ° C とアクセスの 12 h 明暗サイクルの標準の SPF 状態でマウスを飼うため、食料と水。 Ifnar1-/-マウス ZIKV ワクチンを予防接種: AdC7-M/E の 100 μ L を注入 [4 x 1010 (ウイルス粒子)] PBS でバッファー経由で23 G 針を用いて 1 mL 注射器を使用して筋肉内注射 (イオ ミン ルート)。 同様に、PBS の等量とマウス コントロールを挿入します。 3. 脾臓からの単球分離 注: 前述の16脾臓から単球の分離、説明します。 (1 L/分の流量) と 5% イソフルラン インパクター 100% 酸素を使用して免疫と ZIKV に感染したマウス 7 d 後接種を麻酔します。頚部転位によってマウスを安楽死させます。その後、75% エタノールに浸し全体のマウスがすぐに。注意: この手順以降からすべて実験プロシージャの実行すべき無菌バイオ セーフティ キャビネットです。 針を使用して、発泡スチロールの皿に (安楽死、以前感染/免疫) マウスの手足を上向き腹部で固定します。 生殖不能のメスの胸部に腹部の正中線に沿って皮膚をカット、腹部の筋肉をハサミで切って、腹腔内を公開、肝臓を慎重に取り外します。注: 胃の左側に長い、暗赤色の臓器は脾臓です。 脾臓を削除、それを洗い流し、血液を削除し、冷えたロズウェル パーク記念研究所メディア (RPMI) 1.5 mL に PBS で 3 倍。氷の上脾臓を維持します。 脾臓から単一細胞懸濁液を生成するために 50 mL のチューブの上に滅菌 40 μ m メッシュ セル ストレーナー、統轄を配置し、冷たい RPMI 培地含む 10% 牛胎児血清 (FBS) 2 mL を追加します。5 mL シリンジのプランジャーを使用して、機械的に、統轄をマッシュ アップし、器官が完全にメッシュを地面にされるまでメディアを追加します。 15 mL チューブに細胞懸濁液を転送し、4 ° C で 5 分間 600 × gで遠心分離上澄みを除去します。 (NH4Cl、ナ2EDTA、および KHCO3;材料の表を参照してください)、赤血球 (RBC) 換散バッファーの 5 mL の細胞を再懸濁します、5-6 分間室温で溶解反応を孵化させなさい。 10 ml の冷たい RPMI/FBS 中の赤血球溶解を停止し、4 ° C で 5 分間 600 x gでチューブを遠心分離上澄みを除去します。 10 mL (10% 巻/巻 FBS RPMI と 100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン) の完全 RPMI 培地で細胞を再懸濁します。小さなチューブに細胞懸濁液の 10 μ L を転送、0.4 %wt/巻トリパン ブルーの 10 μ L を混ぜて、診断を使用してセルの数をカウントします。 4. 脳や精巣からの単球分離 雄マウスの ZIKV 感染 7 d の後接種、(1 L/分の流量) と 5% isofluranein 100% 酸素を使用してを麻酔します。頚部転位によってマウスを安楽死させます。その後、75% エタノールに浸し全体のマウスがすぐに。注意: このステップからすべて実験手順必要がありますで実行する無菌バイオ セーフティ キャビネットです。脳や精巣からの単球分離は、前述の17に説明します。 まな板の上の腹臥位で (安楽死、以前の感染) の雄マウスを固定します。 ストレート 1 × 2 歯鉗子で頭皮を保護し、頭蓋骨を公開するために頭皮を正中切開アイリスはさみを使用します。 鋭いピンセットで軌道の 2 つの側面をクランプし、脳を修正します。後頭にアイリスはさみの先端を置き、頭蓋骨に横方向にカットします。反対側にこの手順を繰り返します。 使用は鋭いアイリスはさみ鼻に向かって、正中線を同じ空洞から慎重にカットします。はさみの最後の脳の傷害を回避することが可能として表面を維持してください。 鉗子で脳を持ち上げ、脳神経繊維を慎重に分析するアイリスの鋭いはさみを使用します。鉗子で脳を取り出し、冷たい RPMI/10% FBS 培地 5 mL を含む 15 mL チューブにそれを置きます。 腹部の皮膚をピンセットでつかむし、アイリスはさみを使用して外皮と腹部の壁を通して縦切開を行うし、腹部の最下部の一部を公開します。切開まで精巣をプッシュします。軽くピンセットで脂肪層を引き、両側に球状の精巣を公開します。 使用鋭いアイリスはさみ脂肪層および精巣上体を慎重に分析します。鉗子で冷たい RPMI/10% FBS 培地 5 mL を含む 15 mL チューブに精巣を配置します。 単一細胞懸濁液を生成すると、脳や精巣から、50 mL のチューブの上に 100 μ m メッシュと無菌細胞ストレーナーに器官を配置し、冷たい RPMI/10% FBS 媒体の 2 mL を追加します。5 mL シリンジのプランジャーを使用すると、マッシュの器官と器官が完全にメッシュを地面にされるまでメディアを追加します。 15 mL チューブに細胞懸濁液を転送し、4 ° C で 5 分間 600 × gで遠心分離上澄みを除去します。 30% 密度勾配媒体の 5 mL の細胞を再懸濁します、非常にゆっくりと 70% 密度勾配中 15 mL チューブ 2 mL に追加します。 ブレーキ電源、中間層からリンパ球 800 x gで 30 分間取得で 4 ° C でチューブを遠心分離します。 中間期を新しい 15 mL チューブに転送、冷たい RPMI/10% FBS 媒体の 10 mL を追加し、4 ° C で 10 分間 300 x gでチューブを遠心上澄みを除去します。 10 ml の冷たい RPMI/FBS の中の細胞を再懸濁します、4 ° C で 5 分間 600 x gで遠心分離機のこと上澄みを除去します。 完全 RPMI 培地 10 mL で細胞を再懸濁し、ステップ 3.9 のようにセルの数をカウントします。 5. 四量体の準備 NdeI と XohI 制限サイト18pET28a ベクトルを用いた α 3 ドメインと β2m の C 末端にビオチン化サイト タグで H 2 Dbの細胞外ドメインを表現するプラスミドを構築します。 表現し、H 2 Db及び β2m20を前述のようの封入体を準備します。 Renature MHC/ペプチド複合 H 2Db-e294 302を浄化して。 [100 mM トリス-HCl (pH 8.0) 400 mM L-アルギニン、2 ミリメートルの EDTA Na、GSG、5 mM と 0.5 mM GSSG] リフォールディング溶液 200 mL を準備します。プロテアーゼ阻害剤を追加: 2 mL、フッ化物 phenylmethylsulphonyl (PMSF、株式 100 ミリメートル) ペプスタチン (在庫 2 mg/mL) を 100 μ l 添加 leupeptin (在庫 2 mg/mL) を 100 μ l 添加します。30 分間、4 ° C でバッファーをクールします。 H 2 Dbβ2m とペプチドをリフォールディングのソリューションに追加します。 500 μ L のシリンジを使用してグアニジン ソリューション (株式を 30 mg/mL) に溶解した β2m を挿入します。このため、5 mL 注射器 23 G 針を使用し、一滴ずつのリフォールディングのソリューションに β2m を注入します。常に、ゆっくりと 4 ° C で 150 rpm で攪拌ソリューションを保持します。 リフォールディング溶液中 β2m が解散した後、E294 302ペプチド DMSO を 200 μ l 添加の 2 mg を解決し、ピペットを使用してリフォールディングのソリューションにそれを注入します。ゆっくりと 4 ° C 15 分で 150 rpm でソリューションをかき混ぜます。 グアニジン溶液中に溶けて H 2 Dbの 1.5 mL を注入します。4 ° C、8 – 10 h で H 2 Dbの巻き戻し 150 rpm で攪拌バー回転を維持します。注: ソリューションは、冷蔵室でクローズド ボックスに置かれました。 10 kDa の膜を用いた加圧チャンバーにリフォールディングモモルチャリンの蛋白質を集中します。商工会議所に [20 mM トリス-HCl (pH8.0) 50 mM NaCl] バッファーを交換し、30-50 mL の最終巻に集中します。 リフォールディング ソリューションを遠心管に転送し、4 ° C で 15 分間 2,500 x gでスピン 慎重に上清を 10 kDa 遠心フィルターに転送し、さらに 30 分間 2,500 x gで 500 μ L の最終巻に集中。 新鮮なチューブに上清を転送、12,000 × gで 15 分間浄化で S200 をもつタンパク質それをスピン 10/300 GL ゲルろ過クロマトグラフィー。 MHC の複合ピークを収集し、350 μ L の最終巻に集中します。 ビオチン化用 500 μ L 反応のボリュームを生成する次の順序で評議員を追加: 溶液を 100 μ l 添加 [0.5M ビシン (pH 8.3)]、100 μ L のソリューション B (100 mM ATP、100 mM MgOAc、200 µΜ ビオチン)、余分な d-ビオチン (500 µΜ ビオチン) を 100 μ l 添加、Leupeptin (2 mg/mL) の 0.5 μ L、0.5 μ L ペプスタチン (2 mg/mL) の 20 μ L の酵素・ ビラ (60 μ g)。4 ° C で一晩反応管を孵化させなさい注意: 任意の EDTA を biotinylating 反応に追加しないでください。 浄化、S200 を使用して MHC 10/300 GL ゲルろ過クロマトグラフィ任意の余分なビオチンを削除します。 ストレプトアビジン シフト試金18biotinylating 効率を決定します。 A、B、および C、30 分間氷の上の 3 つのサンプルを準備します。10% で結果を分析し、SDS ページ。サンプル A は、ビオチン化 MHC の分子の 8 μ L と交換バッファー、ビオチン化 MHC の分子の 8 μ L のサンプル B と 8 μ L 交換バッファーとストレプトアビジン (20 mg/mL) の 2 μ L のサンプル C ストレプトアビジン (20 mg/mL)、2 μ L の 2 μ L で構成されます。注意: サンプルを沸騰していません。 多量のビオチン標識 MHC 分子を形成します。 モル比が 1:5 すべてのビオチン化の MHC の分子の完全な結合を確保するためにフィコエ リスリン標識ストレプトアビジンとビオチン化 E294 302ペプチド H2Db複雑なを混合して四量体を生成します。 ストレプトアビジン-共役 tetramerization のために必要な量を計算します。 MHC/ペプチド複合体タンパク濃度とモルの重量を占めるのモグラを決定する (例: 総蛋白の 1.8 mg 40 nmol を =)。 MHC/ペプチドのモグラを 5 で割って必要なストレプトアビジン共役のモルの計算 (例: 40/5 = 8 nmol ストレプトアビジン複合体)。 ストレプトアビジン (μ g) で必要とされる金額を計算ストレプトアビジン共役によって (例: ストレプトアビジン PE [300,000 g/M] → 8 必要 nmol = 2,400 g)。 10 個のサンプルにストレプトアビジン フィコエ リスリンを分割します。管内のビオチン化 E294 302ペプチド H2Db複雑な 20 分間隔で各サンプルに追加します。最後のサンプルをロードした後は、暗闇の中で一晩 4 ° C で反応管を孵化させなさい。 100 kDa スピン チューブに multimerized 試薬を適用し、のボリュームに 4 ° C で 2,000 × gで遠心分離で濃縮 < 100 μ L。 4 mL の PBS (pH 8.0) を使用してスピン チューブのサンプルを希釈し、もう一度集中 < 100 μ L。 バッファー交換ステップ PBS (pH 8.0) で繰り返し 4 x。 500 に再度容量を埋める μ L の PBS (pH 8.0) を使用します。4 ° C で 2,000 x gで推定濃度 2 〜 2.5 mg/mL のサンプルを集中します。4 ° C で暗闇の中でサンプルを格納します。 6. フローサイトメトリー 任意の非特異的結合を防ぐために 20 μ L (希釈率 1: 200)、10 分間あたりの抗マウス CD16/CD32 Fc 受容体ブロック試薬の 0.1 μ L で 4 ° c (3.9 のステップやステップ 4.15) から細胞懸濁液を孵化させなさい。 4 ° C で少なくとも 15 分 20,000 × gで 4 量体チューブを遠心分離します。 96 ウェル platecontaining 1 x 10 の6セルにも各細胞懸濁液の 20 μ L を追加します。 すべての実験のチューブを染色する E294 302テトラマー ミックスの十分な量を準備します。アカウントにこのミックスの総量の 15% の過剰をピペッティング エラーに備えます。FACS バッファーで E の294 302テトラマー (2 mg/mL、1 μ L/テスト) を希釈 (PBS、0.5 s) E294 302テトラマー ミックスの 20 μ L を各テストに追加します。 96 ウェル プレートに E294 302テトラマー ミックスの 20 μ L を追加します。この手順の最後に、各ウェルの最終的なボリューム 40 µL.Incubate 30 分間室温で暗闇の中板はずです。 細胞懸濁液に 1 μ L/テストで一次抗体 (FITC 結合または APC 共役の抗 CD3 (0.2 mg/mL)、PerCP 標識抗 CD8 (0.2 mg/mL)) を追加し、その後、暗闇の中で 30 分間、4 ° C で孵化させなさい。 2 セルを洗浄して FACS バッファーおよび 600 x gで 5 分間でそれらは慎重に、上清を吸引し、FACS バッファーの 200 μ L で細胞を再懸濁しますは遠心分離機の 2 ml x。 暗闇の中、フローサイトメトリーによる解析まで 4 ° C で一時的にサンプルを格納します。 フローサイトメトリーによる解析の次のゲートの戦略を使用します。 サイド散布 (SSC) 周辺と前方散乱 (FSC) をプロットすることによって斜めにクラスター化されたシングレットにゲートを作成します。 その後、CD3 にゲート側散布 (SSC)対CD3; による細胞の+次に、CD3 にゲート+ CD8+のセル;最終的には、アウトライン CD8+テトラマー+細胞19。 7. 病理組織学、蛍光抗体法、免疫アッセイ 病理組織学的アッセイ ZIKV 感染 Ifnar1-/-マウス 7 d 後接種の脳および精巣の組織を収集し、4% 中性緩衝ホルムアルデヒドでそれらを修正します。注意: パラホルムアルデヒドは有毒である;適切な保護具を着用します。 組織をパラフィンに埋め込みます。 5 mm、vibratome を使用して組織をセクションします。 ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 組織を染色します。 免疫組織化学的アッセイ Deparaffinize、水分補給、および抗原検索ティッシュ セクション、手順に基づいて説明した21。 PBS (pH 7.6) で 10 分間 3% H2O2で切片を扱い、10 分間の 1% ウシ血清アルブミン (BSA) でそれらをブロックします。 ラット抗マウス CD3 抗体を用いた組織切片を孵化させなさい (希釈: 1/1,000) 室温で 8 時間、その後、一晩で, 4 ° C で。 PBS で組織を洗浄、その後、ビオチン標識二次抗体の 3 滴とそれらを孵化させなさい (希釈: 1/1,000) アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼの 3 滴に続いて、室温で 2 時間 (希釈: 1/200) 30 分間室温で。 バインド、3 滴、30、30-ジアミノベンジジン tetrahydrochloride (希釈: 1/1,000)、22を前述のよう。 マイヤーのヘマトキシリンで切片を counterstain します。 蛍光抗体法 室温で 10 分間凍結精巣セクション (6 mm) を空気乾燥します。 10 分間氷冷アセトンで修正してください。 3 x の PBS でセクションを洗浄し、ブロック バッファーとそれらをブロック (0.3% 1 %bsa トリトン、1x PBS) 37 ° C、30 分で。 一次抗体 (Z6) と組織切片を孵化させなさい (20 μ g/mL) 4 ° C で一晩します。 PBS で組織を洗浄し、二次抗体を適用 (希釈倍率: 1/200) 37 ° C で 1 時間 PBS の切片を洗って 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) を用いた核のそれらを counterstain (希釈倍率: 1/1,000)、製造元の指示に従います。