Valutazione delle risposte a cellula T Zika Virus-specifici in organi di nuova di Ifnar1 infetti^{- / -} Mice

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e Comitato dell’Istituto nazionale di uso per Viral Disease Control and Prevention, CDC di Cina. Tutti gli esperimenti sono stati effettuati seguendo le istituzionali Animal Care e approvato dal comitato di uso animale protocolli. 1. virus infezione Tenere adulto (6-8 settimana-vecchio) Ifnar1- / – (50% uomini e 50% donne) topi/in speciali esenti da patogeni (SPF) condizioni standard e consentire loro di regolare accesso a cibo e acqua. Infettare i topi di Ifnar1- / – con il ZIKV tramite un’inoculazione di retro-orbitale di 100 µ l di ZIKV in un tampone fosfato salino (PBS) tampone 1 x 104 fuoco-unità formanti (FF) del virus. Analogamente, è possibile fornire i topi di controllo con un volume uguale di PBS.Attenzione: Infettare i topi in condizioni ABSL2 ed eseguire queste procedure con topi infettati da virus nella cappa di biosicurezza. Monitorare il peso e segni clinici (tremori, marzo sfalsato, bilaterali dell’arto flaccido) dei topi al giorno per 15 giorni. 2. immunizzazione con il vaccino ZIKV Utilizzare Ifnar1- / – (50% uomini e 50% donne) topi/tra 6 e 8 settimane di età. Tenere i topi in condizioni standard di SPF di 18 – 29 ° C e un ciclo luce/buio di 12 h con accesso a cibo e acqua. Immunizzare i topi di Ifnar1- / – con il vaccino ZIKV: iniettare 100 µ l di AdC7-M/E [4 x 1010 (particelle di virus)] in PBS buffer tramite un’iniezione intramuscolare (i.m. percorso) utilizzando una siringa da 1 mL con ago 23-G. Allo stesso modo, è possibile iniettare topi di controllo con un volume uguale di PBS. 3. isolamento dei monociti dalla milza Nota: L’isolamento dei monociti dalla milza è descritto come accennato in precedenza16. Anestetizzare post-l’inoculazione 7D topi immunizzati e affetti da ZIKV, utilizzando un 5% isoflurane concentrazione 100% ossigeno (con una portata di 1 L/min). Eutanasia i topi di dislocazione cervicale. Quindi, immediatamente immergere tutto il mouse in etanolo di 75%.Attenzione: da questo punto in poi, tutte le procedure sperimentali devono essere eseguite in modo asettico in una cappa di biosicurezza. Usando gli aghi, bloccare gli arti dei topi (eutanasizzati, precedentemente infettati/immunizzati) sulla piastra schiuma con l’addome rivolto verso l’alto. Tagliare la pelle lungo la linea mediana addominale al torace con un bisturi sterile, tagliare i muscoli addominali con le forbici, esporre la cavità addominale e rimuovere delicatamente il fegato.Nota: L’organo lungo, rosso scuro a sinistra dello stomaco è la milza. Rimuovere la milza, risciacquarla 3x in PBS per rimuovere qualsiasi sangue e posizionarlo in 1,5 mL di terreno di Roswell Park Memorial Institute ghiacciata (RPMI). Mantenere la milza sul ghiaccio. Per generare una sospensione unicellulare dalla milza, mettere il organ(s) su un colino di cella sterile 40 µm-mesh sulla cima di un tubo da 50 mL e aggiungere 2 mL di gelida RPMI medium contenente 10% siero bovino fetale (FBS). Utilizzando lo stantuffo di una siringa da 5 mL, meccanicamente poltiglia il organ(s) e aggiungere il terreno fino a quando l’organo è stato completamente terreno attraverso la maglia. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e centrifugare esso a 600 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante. Risospendere le cellule con 5 mL di un tampone di lisi di globuli rossi (RBC) (NH4Cl, Na2EDTA e KHCO3; cfr. la Tabella materiali) e incubare la reazione di Lisi a temperatura ambiente per 5 – 6 min. Interrompere la lisi di RBC con 10 mL di medium RPMI/FBS ghiacciata e centrifugare la provetta a 600 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante. Risospendere le cellule con 10 mL di terreno RPMI completo (RPMI con 10% vol/vol FBS e 100 U/mL penicillina-streptomicina). Trasferire 10 µ l di sospensione cellulare per un piccolo tubo, mescolare con 10 µ l di 0,4% wt/vol trypan blu e contare il numero di celle utilizzando un emocitometro. 4. isolamento dei monociti dal cervello e testicoli Anestetizzare post-l’inoculazione 7D topi maschi affetti da ZIKV, utilizzando 5% isofluranein 100% ossigeno (con una portata di 1 L/min). Eutanasia i topi di dislocazione cervicale. Quindi, immediatamente immergere tutto il mouse in etanolo di 75%.Attenzione: Da questo punto in poi, tutte le procedure sperimentali devono essere eseguite asetticamente in una cappa di biosicurezza. L’isolamento dei monociti dal cervello e testicoli è descritto come accennato in precedenza17. Immobilizzare un topo maschio (eutanasizzato, precedentemente infetto) in posizione prona su un tagliere. Proteggere il cuoio capelluto con un forcipe 1×2 denti dritti e usare le forbici Iris per fare un’incisione del midline sul cuoio capelluto per esporre il cranio. Fissare i due lati delle orbite con pinzette taglienti e difficoltà del cervello. Inserire una punta delle forbici taglienti di Iris il magnum di orifizio e tagliare lateralmente nel cranio. Ripetere questo passaggio per l’altro lato. Uso forte Iris forbici per tagliare accuratamente dalla cavità stessa, fino alla linea mediana, verso il naso. Cercare di mantenere la fine delle forbici come superficiale possibile evitare di ferire il cervello. Sollevare il cervello con il forcipe e utilizzare forbici affilate Iris per sezionare con cura le fibre del nervo cranico. Rimuovere il cervello con il forcipe e metterlo in una provetta da 15 mL contenente 5 mL di medium RPMI/10% FBS ghiacciata. Afferrare la pelle dell’addome con una pinza e utilizzare forbici affilate Iris per praticare un’incisione longitudinale attraverso il tegumento e la parete addominale ed esporre la parte più bassa dell’addome. Spingere i testicoli fino all’incisione. Delicatamente tirare lo strato di grasso con le pinzette ed esporre un testicolo globulare su entrambi i lati. Uso forte Iris forbici per sezionare con cura lo strato di grasso e l’epididimo. Posizionare i testicoli in una provetta da 15 mL contenente 5 mL di terreno di RPMI/10% FBS ghiacciata con il forcipe. Per generare una sospensione unicellulare dal cervello o testicoli, mettere l’organo su un filtro sterile cella con una mesh di 100 µm in cima a un tubo da 50 mL e aggiungere 2 mL di terreno di RPMI/10% FBS ghiacciata. Utilizzando lo stantuffo della siringa 5ml, schiacciate l’organo e aggiungere il terreno fino a quando l’organo è stato completamente terreno attraverso la maglia. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e centrifugare esso a 600 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante. Risospendere le cellule con 5 mL di 30% densità gradiente medio e, quindi, aggiungerli molto lentamente a 2 mL di 70% medio gradiente di densità in una provetta da 15 mL. Spegnere il freno e centrifugare le provette a 4 ° C a 800 x g per 30 min. Ottieni i linfociti dallo strato intermedio. L’interfase di trasferimento in una nuova provetta 15 mL, aggiungere 10 mL di fluido freddo RPMI/10% FBS e centrifugare la provetta a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante. Risospendere le cellule con 10 mL di medium RPMI/FBS ghiacciata e li Centrifugare a 600 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante. Risospendere le cellule con 10 mL di terreno RPMI completo e contare il numero di cellule come descritto al punto 3.9. 5. tetramero preparazione Plasmidi che esprimono domini extracellulari di H-2Db con un tag di sito biotinilati il C-terminale del dominio α3 e il β2m utilizzando il vettore di pET28a con un NdeI e XohI sito di restrizione18. Express e preparare i corpi di inclusione di H-2Db e β2m come descritto in precedenza20. Rinaturazione e purificare il peptide/MHC complesso H-2Db-E294-302. Preparare 200 mL di una soluzione di refolding [100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 400 mM L-arginina, 2 mM EDTA-Na, 5 GSG e 0,5 mM GSSG]. Aggiungere gli inibitori della proteasi: 2 mL di fenilmetilsufonilfluoruro (PMSF, magazzino 100 mM), 100 µ l di pepstatina (stock 2 mg/mL) e 100 µ l di leupeptina (stock 2 mg/mL). Raffreddare il buffer a 4 ° C per 30 min. Aggiungere alla soluzione refoldingbH-2D, β2m e il peptide. Iniettare 500 µ l di β2m disciolti in una soluzione di guanidina (30 mg/mL di brodo) utilizzando una siringa. Per questo, è necessario utilizzare un ago di 23 G con una siringa da 5 mL e iniettare il β2m nella soluzione refolding goccia a goccia. Mantenere la soluzione costantemente e lentamente mescolando a 150 giri/min a 4 ° C. Dopo β2m è stato dissolto nella soluzione di refolding, risolvere 2 mg di peptide di294-302 E in 200 µ l di DMSO e iniettare velocemente nella soluzione di refolding utilizzando una pipetta. Mescolare lentamente la soluzione a 150 giri/min a 4 ° C per 15 min. Iniettare 1,5 mL di H-2Db disciolti in una soluzione di guanidina. Mantenere la stir bar rotante a 150 giri/min per il ripiegamento del H-2Db a 4 ° C per 8-10 h.Nota: La soluzione è stato disposto in una scatola chiusa in una stanza fredda. Concentrare la proteina ripiegata in una camera pressurizzata con una membrana di kDa 10. Scambiare il buffer [20 mM Tris-HCl (pH8.0), 50 mM NaCl] alla camera e concentrarlo in un volume finale di 30 – 50 mL. Trasferire la soluzione di refolding in una provetta da centrifuga e girarla a 2.500 x g per 15 min a 4 ° C. Trasferire con cautela il supernatante a un filtro centrifugo di kDa 10 e concentrarlo ulteriormente ad un volume finale di 500 µ l a 2.500 x g per 30 min. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e girarla a 12.000 x g per 15 min. purificare la proteina con S200 10/300 GL filtrazione cromatografia del gel. Raccogliere il picco di complessi MHC e concentrarlo in un volume finale di 350 µ l. Per generare un volume di reazione di 500-µ l per biotinylation, aggiungere i reggenti nel seguente ordine: 100 µ l di soluzione A [0.5 m bicina (pH 8.3)], 100 µ l di soluzione B (100 mM ATP, 100 mM MgOAc, 200 biotina µΜ), 100 µ l di supplementare d-biotina (biotina 500 µΜ) , 20 µ l di enzima BirA (60 µ g), 0,5 µ l di pepstatin (2 mg/mL) e 0,5 µ l di leupeptin (2 mg/mL). Incubare la provetta di reazione durante la notte a 4 ° C.Attenzione: Non aggiungere qualsiasi EDTA per la reazione di alchilanti. Purificare il MHC utilizzando un S200 colonna di 10/300 GL gel filtrazione per rimuovere qualsiasi biotina supplementare. Determinare l’efficienza di alchilanti con un dosaggio di streptavidina-shift18. Preparare tre campioni, A, B e C, il ghiaccio per 30 min. Quindi, analizzare i risultati di un 10% SDS-PAGE. Campione A è costituito da 8 µ l di molecole di MHC biotinilato e 2 µ l di buffer di scambio, campione B di 8 µ l di molecole di MHC biotinilato e 2 µ l di streptavidina (20 mg/mL) e C di esempio di 2 µ l di streptavidina (20 mg/mL) e 8 µ l di tampone di scambio.Attenzione: Non bollire il campione. Formare dei multimeri delle molecole MHC biotinilato. Produrre tetramero mescolando il biotinilati E294-302 peptide-H2Db complesso con streptavidina ficoeritrina-etichettati con un rapporto di mole di 1:5 per assicurare un legame completo di tutte le molecole di MHC biotinilato. Calcolare la quantità di coniugato streptavidina-necessario per tetramerization. Determinare le talpe dei complessi peptide/MHC contabilità per la concentrazione nella proteina e il peso molare (esempio: 1,8 mg di proteine totali = 40 nmol). Calcolare le talpe del streptavidina-coniugato necessario dividendo le talpe del MHC/peptide per 5 (esempio: 40/5 = 8 nmol di streptavidina-coniugato). Calcolare la quantità di streptavidina necessario (in µ g) a seconda lo streptavidina-coniugato (esempio: streptavidina-PE [300.000 g/M] → 8 nmol necessari = 2.400 g). Dividere streptavidina-ficoeritrina in 10 campioni. Aggiungere ciascun campione in una provetta contenente il biotinilati E294-302 peptide-H2Db complesso, ad intervalli di 20 min. Dopo il caricamento dell’ultimo campione, incubare la provetta di reazione a 4 ° C durante la notte nel buio. Applicare i reagenti multimerized in una provetta da centrifuga 100 kDa e concentrarlo mediante centrifugazione a 2.000 x g a 4 ° C per un volume di < 100 µ l. Diluire il campione nel tubo spin da 4 mL con PBS (pH 8.0) e concentrarlo nuovamente a < 100 µ l. Ripetere lo scambio di buffer passo in PBS (pH 8.0) 4x. Riempire il volume totale nuovamente a 500 µ l utilizzo di PBS (pH 8.0). Concentrare il campione ad una concentrazione stimata di 2 – 2,5 mg/mL a 2.000 x g a 4 ° C. Conservare il campione al buio a 4 ° C. 6. flusso Cytometry Incubare le sospensioni delle cellule (da passo 3.9 e/o passo 4,15) a 4 ° C con 0.1 µ l di Reagente Bloccante di CD16/CD32 Fc-recettore anti-murino a 20 µ l (fattore di diluizione 1: 200) per 10 min, per impedire qualsiasi legame aspecifici. Centrifugare la provetta tetramero a 20.000 x g per almeno 15 min a 4 ° C. Aggiungere 20 µ l di sospensione cellulare a un platecontaining 96 pozzetti 1 x 106 cellule ciascun pozzetto. Preparare un volume sufficiente del mix di tetramero E294-302 a macchiare tutti i tubi sperimentali. Preparare un eccesso del 15% del volume totale di questo mix al conto per errori di pipettaggio. Diluire i tetrameri di294-302 E (2 mg/mL, 1 µ l/test) nel buffer di FACS (PBS, 0,5% FBS) affinché 20 µ l della miscela E294-302 tetramero è aggiunto a ogni test. Aggiungere 20 µ l della miscela tetramero E294-302 per la piastra a 96 pozzetti. Entro la fine di questo passaggio, è opportuno che il volume finale in ciascun pozzetto 40 µL.Incubate la piastra al buio a temperatura ambiente per 30 min. Aggiungere gli anticorpi primari (coniugato FITC o APC-coniugato anti-CD3 (0,2 mg/mL), PerCP-coniugato anti-CD8 (0,2 mg/mL)) a 1 µ l/test alla sospensione di cellule e, quindi, viene quindi incubato a 4 ° C per 30 min al buio. Lavare le cellule 2 x con 2 mL di tampone di FACS e centrifuga con attenzione li a 600 x g per 5 min. aspirare il supernatante e risospendere le cellule con 200 µ l di tampone di FACS. Conservare i campioni temporaneamente a 4 ° C al buio fino a quando l’analisi cytometric di flusso. Utilizzare la seguente strategia di gating per l’analisi cytometric di flusso. Creare un cancello su camiciole diagonalmente cluster tracciando una zona di dispersione (SSC) forward scatter (FSC) contro laterale. Quindi, cancello il CD3 cellule di+ da side scatter (SSC) contro CD3; Successivamente, cancello il CD3+ CD8+ celle; Infine, contorni CD8+ + tetramero cellule19. 7. istopatologia, immunofluorescenza e test immunoistochimico Dosaggio di istopatologia Raccogliere i tessuti cerebrali e testicolo del ZIKV-infettati Ifnar1- / – topi 7D post-inoculazione e fissarli in 4% neutra tamponata formaldeide.Attenzione: paraformaldeide è tossico; indossare adeguati dispositivi di protezione personale. Incorporare il tessuto in paraffina. Sezione del tessuto a 5 mm utilizzando un vibratomo. Macchiare il tessuto con ematossilina ed eosina (H & E). Test immunoistochimico Deparaffinizzare, reidratare e antigene-recuperare il tessuto sezioni, sulla base di procedure descritte precedentemente21. Trattare le sezioni di tessuto con 3% H2O2 in PBS (pH 7,6) per 10 min e bloccarli con 1% di albumina di siero bovino (BSA) per 10 min. Incubare le sezioni di tessuto con anticorpo di topo anti-topo CD3 (diluizione: 1/1.000) per 8 h a temperatura ambiente e, quindi, li Incubare a 4 ° C durante la notte. Sciacquare i tessuti con PBS e, quindi, incubare li con 3 gocce di anticorpo secondario biotinilato (diluizione: 1/1.000) per 2 h a temperatura ambiente, seguita da 3 gocce di avidina-biotina-perossidasi (diluizione: 1/200) a temperatura ambiente per 30 min. Associare, con 3 gocce di 30, 30-diaminobenzidina tetrahydrochloride (diluizione: 1/1.000), come descritto in precedenza22. Colorante di contrasto le sezioni di tessuto con ematossilina di Mayer. Analisi di immunofluorescenza Asciugare le sezioni congelate testicolo (6 mm) per 10 min a temperatura ambiente. Fissarle con acetone ghiacciata per 10 min. Lavare le sezioni con PBS per 3x e bloccarli con un tampone di bloccaggio (BSA 1%, 0,3% Triton, 1x PBS) a 37 ° C per 30 min. Incubare le sezioni di tessuto con l’anticorpo primario (Z6) (20 µ g/mL) a 4 ° C durante la notte. Sciacquare i tessuti con PBS e applicare l’anticorpo secondario (fattore di diluizione: 1/200) per 1 h a 37 ° C. Lavare le sezioni di tessuto con PBS e li colorante di contrasto per nuclei con 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (fattore di diluizione: 1/1.000), seguendo le istruzioni del produttore.