Évaluation des réponses de cellules T spécifiques du Virus Zika dans les organes Immunoprivileged des Ifnar1 infecté les souris^{- / -}

Des expérimentations animales ont été approuvées par le Comité d’Institut National de l’emploi et d’institutionnels animalier Viral Disease Control and Prevention, CDC Chine. Toutes les expériences ont été effectuées après l’animalier institutionnel et approuvé par Comité de l’utilisation des protocoles animales. 1. infection par le virus Gardez adulte (6 à 8 semaines) Ifnar1- / – (50 % d’hommes et 50 % de femmes) souris/standard exempts de micro-organismes pathogènes (SPF) des prescriptions spéciales et leur permettre un accès régulier à l’eau et de nourriture. Infecter les Ifnar1- / – souris avec le ZIKV via une inoculation de rétro-orbitaire de 100 µL de ZIKV dans un tampon phosphate salin (PBS) mémoire tampon contenant 1 x 104 focus formant des unités (FFUs) du virus. De même, fournissent des souris témoins avec un volume égal de PBS.ATTENTION : Infecter les souris dans des conditions ABSL2 et exécuter ces procédures sur des souris infectées par le virus dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet. Surveiller le poids et les signes cliniques (tremblements, quinconce mars, patte flasque bilatérale) des souris par jour pendant 15 jours. 2. la vaccination avec le vaccin ZIKV Utilisez Ifnar1 souris- / – (50 % d’hommes et 50 % de femmes) entre 6 et 8 semaines d’âge. Gardez les souris dans des conditions standard de SPF de 18 à 29 ° C et un cycle lumière/obscurité de 12 h avec accès à la nourriture et l’eau. Vacciner les Ifnar1- / – souris avec le vaccin ZIKV : injecter 100 µL de AdC7-M/E [4 x 1010 (particules virales)] dans du PBS tampon via une injection intramusculaire (voie i.m.) à l’aide d’une seringue de 1 mL avec une aiguille 23-G. De même, injecter des souris témoins avec un volume égal de PBS. 3. isoler les Monocytes de la rate Remarque : L’isolement des monocytes de la rate est décrit comme mentionné plus haut16. Anesthésier la souris immunisées et infectées par le ZIKV 7D après l’inoculation, à l’aide d’un 5 % isoflurane concentrationin 100 % d’oxygène (avec un débit de 1 L/min). Euthanasier les souris par dislocation cervicale. Puis, immédiatement tremper la souris toute en éthanol 75 %.ATTENTION : d’à partir de cette étape, toutes les procédures expérimentales doivent être effectuées aseptiquement dans une armoire de sécurité biologique. À l’aide d’aiguilles, fixer les branches des souris (euthanasiés, précédemment infectés/immunisés) sur la plaque de mousse avec l’abdomen vers le haut. Couper la peau le long de la ligne médiane abdominale au thorax avec un scalpel stérile, couper les muscles abdominaux avec des ciseaux, exposition de la cavité abdominale et retirer délicatement le foie.Remarque : L’orgue longue, rouge foncé à gauche de l’estomac est la rate. Enlever la rate, le rincer 3 fois dans du PBS pour enlever le sang et placez-le dans 1,5 mL de milieu glacé de Roswell Park Memorial Institute (RPMI). Garder la rate sur la glace. Pour générer une suspension de cellules individuelles de la rate, placez l’organe ou les organes sur un tamis de cellule stérile maille de 40 µm-au sommet d’un tube de 50 mL et ajouter 2 mL de glacé RPMI moyen contenant 10 % foetale de sérum bovin (FBS). En utilisant le piston d’une seringue de 5 mL, mécaniquement écraser l’organe ou les organes et ajouter le support jusqu’à ce que l’orgue a été entièrement au sol à travers les mailles. Transférer la suspension de cellules dans un tube de 15 mL et il centrifuger à 600 x g pendant 5 min à 4 ° C. Retirez le surnageant. Remettre en suspension les cellules avec 5 mL d’un tampon de lyse des globules rouges (GR) (NH4Cl, Na2EDTA et KHCO3; Voir la Table des matières) et incuber la réaction de lyse à température ambiante pendant 5 à 6 min. Arrêter la lyse de RBC avec 10 mL de glacee milieu RPMI/FBS et centrifuger le tube à 600 x g pendant 5 min à 4 ° C. Retirez le surnageant. Remettre en suspension les cellules avec 10 mL de milieu RPMI complet (RPMI avec 10 % vol/vol FBS et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine). Transférer 10 µL de la suspension cellulaire à un petit tube, mélangez-le avec 10 µL de 0,4 % wt/vol bleu trypan et compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre. 4. isolement des Monocytes du cerveau et des testicules Anesthésier la souris mâles infectés par ZIKV 7D après l’inoculation, à l’aide de 5 % ilexistedansl 100 % d’oxygène (avec un débit de 1 L/min). Euthanasier les souris par dislocation cervicale. Puis, immédiatement tremper la souris toute en éthanol 75 %.ATTENTION : De partir de cette étape, toutes les procédures expérimentales doivent être effectuées stérilement dans une armoire de sécurité biologique. L’isolement des monocytes du cerveau et les testicules est décrite comme mentionné plus haut17. Immobiliser une souris mâle (euthanasiée, précédemment infectée) en position couchée sur une planche à découper. Fixer le cuir chevelu avec une pince de 1 x 2 dents droites et utiliser des ciseaux Iris de faire une incision médiane sur le cuir chevelu pour exposer le crâne. Serrez les deux côtés des orbites avec pince à épiler pointu et fixer le cerveau. Placer une pointe de ciseaux pointus de Iris dans le trou occipital et coupez latéralement dans le crâne. Répétez cette étape pour l’autre côté. Utilisez un pointu Iris ciseaux pour couper avec précaution de la cavité même, jusqu’à la ligne médiane, vers le nez. Essayez de garder la fin des ciseaux aussi superficiel que possible pour ne pas blesser le cerveau. Soulever le cerveau avec une pince et se servir des ciseaux pointus de Iris à disséquer attentivement les fibres de nerf crânien. Enlever le cerveau avec une pince et le placer dans un tube de 15 mL contenant 5 mL de milieu de FBS RPMI/10% glacée. Prenez la peau abdominale avec une pince et ciseaux pointus de Iris permet de faire une incision longitudinale à travers le tégument et la paroi abdominale et exposer la partie la plus basse de l’abdomen. Poussez les testicules jusqu’à l’incision. Doucement, retirer la couche de graisse avec des pincettes et exposer un testicule globulaire des deux côtés. Utilisation forte Iris ciseaux pour disséquer soigneusement la couche de graisse et de l’épididyme. Placer les testicules dans un tube de 15 mL contenant 5 mL de milieu de FBS RPMI/10% glacée avec une pince. Pour générer une suspension de cellules individuelles dans le cerveau ou les testicules, placer l’orgue sur un tamis de cellule stérile avec une maille de 100 µm au sommet d’un tube de 50 mL et ajouter 2 mL de milieu de FBS RPMI/10% glacée. En utilisant le piston d’une seringue de 5 mL, écraser l’orgue et ajouter moyen jusqu’à ce que l’orgue a été entièrement au sol à travers les mailles. Transférer la suspension de cellules dans un tube de 15 mL et il centrifuger à 600 x g pendant 5 min à 4 ° C. Retirez le surnageant. Remettre en suspension les cellules avec 5 mL de milieu gradient de densité 30 % et, ensuite, ajouter très lentement à 2 mL de milieu de gradient de densité 70 % dans un tube de 15 mL. Couper le frein et centrifuger les tubes à 4 ° C à 800 g pendant 30 min. obtenir les lymphocytes de la couche intermédiaire. Transférer l’interphase dans un nouveau tube de 15 mL, ajouter 10 mL de milieu de FBS RPMI/10% froid et centrifuger le tube à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C. Retirez le surnageant. Remettre en suspension les cellules avec 10 mL de glacee milieu RPMI/FBS et eux centrifuger à 600 x g pendant 5 min à 4 ° C. Retirez le surnageant. Remettre en suspension les cellules avec 10 mL de milieu RPMI complet et compter le nombre de cellules comme à l’étape 3.9. 5. tétramère préparation Construire des plasmides exprimant les domaines extracellulaires de H-2Db avec un tag de site biotinylé sur l’extrémité C-terminale du domaine α3 et la β2m en utilisant le vecteur de pET28a avec une restriction site Ndel et XohI18. Express et préparer les corps d’inclusion de H-2Db et β2m comme décrit plus haut20. Rature et purifier le MHC/peptide complexe H-2Db-E294-302. Préparez 200 mL d’une solution de repliement [100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 400 mM de L-arginine, 2 mM, EDTA sodique, 5 GSG et 0,5 mM GSSG]. Ajouter des inhibiteurs de la protéase : 2 mL de fluorure de sulfonyle (PMSF, stock 100 mM), 100 µL de pepstatine (stock 2 mg/mL) et 100 µL de leupeptine (stock 2 mg/mL). Cool le tampon à 4 ° C pendant 30 min. Ajoutez H-2Db, β2m et peptide à la solution de repliement. Injecter 500 µL de β2m dissoute dans une solution de guanidine (stock de 30 mg/mL) à l’aide d’une seringue. Pour ce faire, utilisez une aiguille 23 G avec une seringue de 5 mL et injecter la β2m dans la solution de repliement goutte à goutte. Conserver la solution constamment et lentement en remuant à 150 tr/min à 4 ° C. Après que β2m a été dissous dans la solution de repliement, résoudre 2 mg de peptide294-302 E dans 200 µL de DMSO et injecter rapidement dans la solution de repliement à l’aide d’une pipette. Incorporer lentement la solution à 150 tr/min à 4 ° C pendant 15 min. Injecter 1,5 mL de H-2Db dissous dans une solution de guanidine. Garder l’émoi bar tournant à 150 tr/min pour le repliement de la H-2Db à 4 ° C pendant 8 à 10 h.Remarque : La solution a été placée dans une boîte fermée dans une chambre froide. Concentrer la protéine replissée dans une chambre pressurisée avec une membrane kDa 10. Échange de la mémoire tampon [20 mM Tris-HCl (pH8.0), 50 mM NaCl] à la chambre et il se concentrer pour un volume final de 30 à 50 mL. Transférer la solution repliement dans un tube à centrifuger et faire tourner à 2 500 g pendant 15 min à 4 ° C. Transvaser avec soin le surnageant à un filtre centrifuge à 10 kDa et concentrer davantage pour un volume final de 500 µL à 2 500 g pendant 30 min. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et faire tourner à 12 000 g pendant 15 min. purifier la protéine avec S200 10/300 GL de chromatographie de filtration sur gel. Recueillir le pic complex MHC et concentrer pour un volume final de 350 µL. Pour générer un volume réactionnel de 500 µL pour biotinylation, ajouter les régents dans l’ordre suivant : 100 µL de la solution A [0. 5 m bicine (pH 8,3)], 100 µL de solution B (ATP, 100 mM, MgOAc, 200 biotine µΜ 100 mM), 100 µL d’appoint d-biotine (biotine de 500 µΜ) , 20 µL d’enzyme BirA (60 µg), 0,5 µL de pepstatine (2 mg/mL) et 0,5 µL de leupeptine (2 mg/mL). Incuber le tube de réaction pendant une nuit à 4 ° C.ATTENTION : N’ajoutez pas de n’importe quel EDTA à la réaction de biotinylating. Purifier le MHC utilisant un S200 colonne de filtration sur gel 10/300 GL pour supprimer toute biotine supplémentaire. Déterminer l’efficacité de biotinylating avec un dosage de streptavidine-MAJ18. Préparer les trois échantillons, A, B et C, sur la glace pendant 30 min. Ensuite, analyser les résultats d’un 10 % SDS-PAGE. Échantillon A se compose de 8 µL de molécules du CMH biotinylé et 2 µL de tampon d’échange, échantillon B 8 µL de molécules du CMH biotinylé et 2 µL de streptavidine (20 mg/mL) et échantillon C 2 µl de streptavidine (20 mg/mL) et 8 µL de tampon de change.ATTENTION : Ne pas faire bouillir l’échantillon. Former des multimères des biotinylées MHC. Produire tétramère en mélangeant le biotinylé E294-302 peptide-H2Db complexe streptavidine marquée phycoérythrine à un rapport molaire de 1:5 pour assurer une liaison complète de toutes les molécules du CMH biotinylé. Calculer la quantité de conjugué streptavidine-nécessaire pour tétramérisation. Déterminer les taupes des complexes MHC/peptide représente la concentration de protéines et la masse molaire (exemple : 1,8 mg de protéine totale = 40 nmol). Calculer les taupes du besoin en divisant les taupes du MHC/peptide par 5-conjugué streptavidine (exemple : 40/5 = 8 nmol de streptavidine-conjugué). Calculer le montant de streptavidine (en µg) selon le conjugué streptavidine (exemple : streptavidine-PE [300 000 g/M] → 8 nmol nécessaire = 2 400 g). Divisons 10 échantillons de streptavidine-phycoérythrine. Ajouter chaque échantillon dans un tube contenant le biotinylé E294-302 peptide-H2Db complexe, à un intervalle de 20 min. Après avoir chargé le dernier échantillon, incuber le tube de réaction à 4 ° C durant la nuit dans l’obscurité. Appliquer les réactifs multimerized dans un tube de spin de 100 kDa et concentrer par centrifugation à 2 000 x g à 4 ° C pour un volume de < 100 µL. Diluer l’échantillon dans le tube de spin à 4 mL à l’aide de PBS (pH 8,0) et concentrer encore < 100 µL. Répétez l’étape l’échange de la mémoire tampon dans du PBS (pH 8,0) x 4. Remplir le volume total de plus de 500 µL à l’aide de PBS (pH 8,0). Concentrer l’échantillon à une concentration estimée de 2 à 2,5 mg/mL à 2 000 x g à 4 ° C. Conserver l’échantillon dans l’obscurité à 4 ° C. 6. cytométrie en flux Incuber les suspensions cellulaires (de l’étape 3,9 et/ou étape 4.15) à 4 ° C 0.1 µl de réactif de blocage de récepteurs Fc-CD16/CD32 anti-murin par 20 µL (dilution facteur 1 : 200) pendant 10 min, pour éviter toute liaison non-spécifique. Centrifuger le tube de tétramère à 20 000 x g pendant au moins 15 min à 4 ° C. Ajouter 20 µL de la suspension cellulaire à un 96 puits platecontaining 1 x 106 cellules chaque puits. Préparer un volume suffisant du mix E294-302 tétramère de colorer tous les tubes expérimentales. Préparer un excès de 15 % du volume total de ce mélange au compte pour les erreurs de pipetage. Diluer les tétramères de294-302 E (2 mg/mL, 1 µL/test) dans un tampon de FACS (PBS, 0,5 % FBS) afin que 20 µL du mélange E294-302 tétramère est ajoutée à chaque test. Ajouter 20 µL du mélange tétramère294-302 E à la plaque à 96 puits. À la fin de cette étape, le volume final de chaque puits devrait être 40 µL.Incubate la plaque dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 min. Ajouter des anticorps primaires (conjugué FITC ou APC conjugué anti-CD3 (0,2 mg/mL), PerCP-conjugué anti-CD8 (0,2 mg/mL)) à 1 µL/test à la suspension cellulaire et, ensuite, incuber il à 4 ° C pendant 30 min à l’obscurité. Laver les cellules 2 x avec 2 mL de tampon de FACS et centrifuger à 600 x g pendant 5 min. soigneusement aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 200 µL de tampon de FACS. Stocker les échantillons temporairement à 4 ° C dans l’obscurité jusqu’à ce que la cytométrie. Utilisez la stratégie de blocage suivante pour la cytométrie. Créez un portail sur les maillots en diagonale en cluster en traçant une zone de diffusion (SSC) forward scatter (FSC) versus le côté. Puis, porte sur le CD3+ cellules de côté diffusion (SSC) versus CD3 ; Ensuite, porte sur le CD3+ CD8+ cellules ; Enfin, exposer brièvement CD8+ tetrámeras+ cellules19. 7. histopathologie, Immunofluorescence et dosage de l’immunohistochimie Dosage de l’histopathologie Recueillir les tissus de cerveau et les testicules de la Ifnar1 infectées par le ZIKV- / – souris 7D après l’inoculation et fixez-les en formaldéhyde tampon neutre à 4 %.ATTENTION : paraformaldéhyde est toxique ; porter un équipement de protection individuelle approprié. Incorporer le tissu à la paraffine. Section de tissu à 5 mm à l’aide d’un vibratome. Tacher le tissu à l’hématoxyline et éosine (H & E). Dosage de l’immunohistochimie Déparaffiner, s’hydrater et antigène-récupérer le tissu sections, basées sur des procédures décrites précédemment21. Traiter les sections de tissu avec 3 % H2O2 dans du PBS (pH 7,6) pendant 10 min et les bloquer avec 1 % sérum d’albumine bovine (BSA) pendant 10 min. Incuber les sections de tissu avec des anticorps CD3 de rat anti-souris (dilution : 1/1 000) pendant 8 h à température ambiante et, ensuite, les incuber à 4 ° C jusqu’au lendemain. Rincer les tissus avec du PBS et, ensuite, les incuber avec 3 gouttes de secondaire biotinylé (dilution : 1/1 000) pendant 2 h à température ambiante, puis 3 gouttes de l’avidine-biotine-peroxydase (dilution : 1/200) à température ambiante pendant 30 min. Lier, avec 3 gouttes de 30, 30-diaminobenzidine tétrahydrochlorure (dilution : 1/1 000), comme décrit plus haut22. Contre-coloration les coupes de tissus avec l’hématoxyline de Mayer. Test d’immunofluorescence Sécher les sections de testicules gelés (6 mm) pendant 10 min à température ambiante. Fixez-les à l’acétone glacée pendant 10 min. Laver les sections avec PBS pour x 3 et les bloquer avec un tampon de blocage (1 % de BSA, 0,3 % Triton, solution 1 PBS x) à 37 ° C pendant 30 min. Incuber les coupes de tissus avec de l’anticorps primaire (Z6) (20 µg/mL) à 4 ° C la nuit. Rincer les tissus avec du PBS et appliquer l’anticorps secondaire (facteur de dilution : 1/200) pendant 1 h à 37 ° C. Laver les sections de tissu avec du PBS et eux contre-coloration pour les noyaux à l’aide de 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (facteur de dilution : 1/1 000), suivant les instructions du fabricant.