تقييم الاستجابات الخاصة بفيروس زيكا تي خلية في أجهزة إيمونوبريفيليجيد من الفئران المصابة Ifnar1-/-
Summary
ويرد وصف بروتوكول لتقييم استجابات محددة مستضد تي خلية في أجهزة إيمونوبريفيليجيد Ifnar1-/- نموذج مورين لعدوى فيروس (زيكف) زكى. هذا الأسلوب هو محوري للتحقيق في آليات حماية الخلايا وإيمونوباثوجينيسيس من اللقاحات زيكف وهو أيضا قيمة لتقييم فعالية.
Abstract
يمكن حمل الفيروس Zika (زيكف) التهاب في إيمونوبريفيليجيد الأجهزة (مثلالدماغ والخصية)، مما يؤدي إلى متلازمة غيلان-باريه وإلحاق أضرار بالخصيتين. خلال عدوى مع زيكف، أظهرت الخلايا المناعية التسلل إلى داخل الأنسجة. ومع ذلك، الآليات الخلوية التي تقوم بتعريف الحماية و/أو إيمونوباثوجينيسيس من هذه الخلايا المناعية أثناء مرض زيكف لا تزال مجهولة إلى حد بعيد. هنا، يمكننا وصف أساليب تقييم الوظائف تي خلية خاصة بالفيروس في هذه الأجهزة إيمونوبريفيليجيد من الفئران المصابة زيكف. وتشمل هذه الأساليب) العدوى زيكف ولقاحات التطعيم في الفئران-/- Ifnar1؛ ب) الأنسجة، الفلورة وفحوصات إيمونوهيستوتشيميستري للكشف عن الإصابة بالفيروسات والتهاب في المخ والخصيتين، والطحال؛ ج) إعداد تيترامير المستمدة من زيكف تي خلية [ابيتوبس]؛ د) الكشف عن خلايا تي زيكف على حدة في وحيدات المعزولة من المخ والخصيتين، والطحال. استخدام هذه النهج، فمن الممكن للكشف عن الخلايا T مستضد الخاصة التي تسللوا إلى أجهزة إيمونوبريفيليجيد وتقييم وظائف هذه الخلايا T خلال العدوى: حماية الحصانة المحتملة عن طريق إزالة الفيروسات و إيمونوباثوجينيسيس/أو إلى تفاقم الالتهاب. هذه النتائج قد يساعد أيضا على توضيح مساهمة خلايا تي الناجمة عن التطعيم ضد زيكف.
Introduction
زيكف هو مصفر المنقولة بالبعوض التي كانت معزولة أولاً في عام 1947 في أوغندا من المكاك الريسوسي حموية. في الآونة الأخيرة، أصبح زيكف حالة طوارئ صحة العامة، بسبب نشرها السريع في الأمريكتين وعلاقته غير متوقع لصغر الرأس ومتلازمة غيلان-باريه متلازمة1،،من23. من البيانات الوبائية، يشتبه في زيكف أن يكون سبب متلازمة غيلان-باريه في حوالي 1 في 4,000 إصابة البالغين4. وعلاوة على ذلك، وجود ارتباط بين زيكف والخصيتين العدوى/الضرر في طراز الماوس قد ثبت، مما يوحي بأن العدوى زيكف، تحت ظروف معينة، يمكن تجاوز حاجز الدم-الخصية ويؤدي في النهاية إلى العقم عند الذكور5 . هذه النتائج تسلط الضوء على أهمية فهم تماما تنظيم دورات تعريفية للاستجابات المناعية الواقية أو باثولوجي أثناء مرض زيكف.
الكثير مما يمكن تعلمه عن الاستجابات المناعية الخلوية زيكف. خلايا CD4+ و CD8+ تي خلية الردود قفيصه والمغلف، والبروتين نونستروكتورال 1 (NS1) قد لوحظت في إصابة زيكف القردة والبشر6،،من78. في الفئران، أشارت عدة دراسات إلى أن CD8+ تي الخلايا دوراً حمائياً في مراقبة النسخ المتماثل زيكف9،،من1011. الأهم من ذلك، أثبتت خورادو et al. أن عدوى زيكف يؤدي إلى انهيار حاجز الدم في الدماغ وارتشاح تسلل CD8+ خلايا المستجيب تي داخل الخصيتين Ifnar1–/– الفئران. وعلاوة على ذلك، أنها أظهرت أن CD8+ تي الخلايا تحرض الشلل المرتبطة زيكف ويبدو أن تلعب دوراً في إيمونوباثولوجي الدماغ الولدان. في دراسة سابقة، أعد تيترامير294-302 ه زيكف، وأظهرت أن CD8 زيكف الخاصة+ تي خلايا موجودة في العقول والحبال الشوكي لفئران مصابة زيكف Ifnar1-/- ، التي قد يكون لها آثار هامة على التصميم وتطوير اللقاحات زيكف10.
في استجابة للحاجة الملحة للتطعيم الوقاية من الإصابة زيكف، عدة لقاحات في المراحل الإكلينيكية للتنمية، بما في ذلك اللقاحات واللقاحات المؤتلف متجهة البروتين المنقي فرعية للقاحات الحمض النووي الريبي. لقاح بلازميد الحمض النووي في مرحلة التجارب السريرية 112. تقييم سلامة وفعالية اللقاحات زيكف، لذلك، المهم. ميزة واحدة من اللقاحات هي قدرتها على الحصول على ردود تي خلية محددة، التي قد تكون هامة للحماية زيكف. يمكن الكشف عن إيممونوريكتيفيتي تي خلية الناجم عن لقاح زيكف إتش-vector-تعتمد باستخدام المشتقة من زيكف تي خلية المتصلة حانمه tetramers، في الفئران تحصينا، وعرضت glycoproteins م وه لحمل قوية محددة مستضد CD8+ تي خلية إيمونوريكتيفيتي13.
أثناء الإصابة بعدوى فيروس، الاعتراف المستضدات الببتيد المقدمة من الجزيئات (MHC) المعقدة هيستوكومباتيبيليتي الرئيسية لمستقبلات خلايا تي (تكر) إليه هامة لحماية المضيف14خلية توسطت T. وبناء على هذه النظرية، تيترامير التكنولوجيا هي أداة فريدة توضيح الأدوار التي تؤديها خلايا تي مستضد محددة في تنظيم الاستجابات المناعية15. ويصف هذا البروتوكول إنشاء Ifnar1-/- طراز الماوس للالتهابات زيكف، والكشف عن خلايا تي رد الفعل في الطحال والدماغ، والخصيتين للفئران باستخدام تكنولوجيا تيترامير. بالإضافة إلى ذلك، استخدمنا تيترامير294-302 ه زيكف لاكتشاف وتقييم إيمونوريكتيفيتي تي خلية الناجم عن لقاح زيكف (AdC7-M/E) في الفئران المحصنين. هذه الدراسة توفر التوجيه للتحقيق في الردود تي خلية في أجهزة إيمونوبريفيليجيد ويوفر مرجعاً للتطبيقات المحتملة في مخ الجنين أو المشيمة.
Protocol
Representative Results
Discussion
مكسبه تي خلية حانمه تلعب دوراً هاما في الخلوية الحصانة ضد العوامل الممرضة23. وهكذا، الكشف عن خلايا تي زيكف على حدة في أجهزة إيمونوبريفيليجيد منهجية حاسمة لفهم الاستجابات تي خلية مكافحة العدوى زيكف الطبيعية. وفي الوقت نفسه، الكشف عن استجابة خلايا T أداة ممتازة للتحقيق في مدى فعالية اللقاحات الفيروسية. وهنا نعرض بروتوكول شامل لتصور هذه التجارب، التي تشمل عزل الخلايا الليمفاوية من الطحال والدماغ، والخصيتين من الفئران المصابة زيكف، إعداد تيترامير294-302 حانمه ه إيمونودومينانت، الاعتراف CD8 الخاصة زيكف+ تي الخلايا في أجهزة إيمونوبريفيليجيد من الفئران المصابة زيكف.
وأظهرت دراسة سابقة أنه يمكن الكشف عن زيكف العيش أو الحمض النووي الريبي في السائل المنوي المرضى الذكور، مما يشير إلى أن زيكف يمكن تجاوز حاجز الدم-الخصية وينسخ نفسه في الجهاز التناسلي24. سابقا، كما أظهرت أن زيكف يمكن أن يسبب تلف الخصيتين ويؤدي إلى العقم عند الذكور في الفئران25. يمكن أن تؤدي الإصابة زيكف إلى فريميا في القرود ريسوس، ويمكن الكشف عن الجيش الملكي النيبالي الفيروسية في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وكذلك في أجهزة الحشوي. وكشف إيمونوهيستوتشيميستري أن المستضدات الخاصة زيكف وعرضت في الجهاز العصبي المركزي و الأجهزة الطرفية متعددة26. أيضا، في نماذج مورين، يمكن حمل العدوى زيكف CD8 المضادة للفيروسات قوية+ استجابة خلايا T في الطحال والجهاز العصبي المركزي26.
مقارنة بالأعمال السابقة، تحدد هذه الدراسة أساليب منهجية للكشف عن CD8 الخاصة زيكف+ تي خلية الردود في المخ والخصيتين، ومواقع إيمونوبريفيليجيد. من المهم تقييم الأداء الوظيفي للخلايا التائية الخاصة بالفيروسات في أجهزة إيمونوبريفيليجيد من الفئران المصابة زيكف. استخدام تيتراميرس للكشف عن CD8 الخاصة زيكف+ تي خلية الردود في أجهزة إيمونوبريفيليجيد من شأنه أن يعزز فهمنا للالتهابات زيكف وعلى الاستجابات المناعية المضيف. استخدام تيترامير294-302 ه، يمكن عزل خلايا تي الخاصة بفيروس في المخ والخصية بالتدفق الخلوي، للتحقيق الخلوية آليات الحماية وإيمونوباثوجينيسيس أثناء مرض زيكف. وفي الوقت نفسه، أنه من المفيد للباحثين مواصلة التحقيق مهام CD8+ تي الخلايا للتحكم في زيكف، أو لتحسين إيمونوباثوجينيسيس في هذه الأجهزة أثناء الإصابة زيكف.
لتحليل CD8 مورين حدة مستضد+ تي خلية الردود في أجهزة إيمونوبريفيليجيد، أعد 2D حبتيترامير294-302 -E والكشف عن CD8+ تي الخلايا بالتدفق الخلوي. Tetramers أداة قوية للكشف عن خلايا محددة مستضد تي. هنا، تم إنشاء ثلاثة أنواع من ستريبتافيدين fluorochrome مترافق (آسيا والمحيط الهادئ، بي، و BV421). على الرغم من أن هناك لا توجد فروق معتد بها إحصائيا في آسيا والمحيط الهادئ-BV421-، و tetramers المسمى PE للكشف عن خلايا تي محددة مستضد، المسمى PE الرهن العقاري–أنا tetramers تسفر عن نتائج أفضل. ومن ثم، تم استخدام تيترامير المسمى PE طوال هذه الدراسة. من المثير للاهتمام، استناداً إلى تيترامير294-302 -E 2D ح PE المسمىب، اكتشفنا نسب عالية من خلايا تي حدة مستضد في المخ والخصيتين، مما يشير إلى قدرة الخلايا T الخاصة بالفيروس من الدم للهجرة أجهزة إيمونوبريفيليجيد.
ومع ذلك، توجد بعض القيود على البروتوكول. تيترامير294-302 -E 2D حبلأنه غير مفيد للبشرية تي خلية الكشف، كشف تيترامير مرهون بتقييد MHC. يزال يلزم فحص الببتيدات المقيدة-هلا إيمونودومينانت. إلى جانب ذلك، عدوى الرجعية-المداري فعال لعدوى زيكف ولكن قد لا تكون عملية ملائمة لبعض المحققين. وهكذا، وطرق أخرى للعدوى، بما في ذلك البريتوني، أو تحت الجلد، أو عن طريق الحقن الوريدي، يوصي أيضا.
في البروتوكول هو موضح هنا، هو خطوة حاسمة عزلة وحيدات من الدماغ والخصية. من المهم الحصول على الخلايا الليمفاوية عالية الجودة؛ وبالتالي، من المهم إيلاء الاهتمام إلى، على سبيل المثال، سرعة الطرد المركزي، قوة الأنسجة الطحن، وتشريح أنسجة المخ والخصية. وإلى جانب ذلك، لإعداد تيترامير, مثبطات البروتياز (بمسف، بيبستاتين، ليوبيبتين) مفيدة عند حماية بروتين من تتعرض للتدهور. ولذلك، فمن المنطقي لإضافة مثبط البروتياز إلى المخزن المؤقت ريفولدينج وتبادل المخزن المؤقت أثناء عملية إعداد تيترامير.
وفي الختام، فإننا نقدم أساليب الكشف عن استجابات تي خلية محددة مستضد في أجهزة إيمونوبريفيليجيد Ifnar1-/- نموذج الماوس لعدوى زيكف. يمكن تطبيق هذا المنهاج على نطاق واسع للتحقيق في آليات محصنة والناشئة من جديد الفيروسات التي يمكن تجاوز الحواجز بين الدم وأجهزة إيمونوبريفيليجيد. وعلاوة على ذلك، هذه الدراسة قد تمهد الطريق للتنمية المستقبلية للقاحات المرشحة وإيمونوثيرابيس.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون غاري وونغ لتنقيح اللغة الإنجليزية. وأيده هذا العمل الوطني للبحوث الرئيسية وبرنامج التنمية في الصين (منحة 2017YFC1200202)، المشاريع الخاصة الرئيسية “بحوث الأمراض الصين المعدية” (منحة 2016ZX10004222-003). جورج ف. قاو محقق رئيسية رائدة في العلوم الطبيعية مؤسسة من الصين مبتكرة البحث الفريق الوطني (منحة 81621091).
Materials
| Z6 | our lab | Ma W, Li S, Ma S, et al. Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510 | |
| CD3 | Santa Cruz | sc-1127; RRID: AB_631128 | |
| Fluorescein-Conjuated Affinipure Goat anti-human IgG(H+L) | ZSGB-BIO | ZF-0308 | |
| Rabbit Anti-Goat IgG, FITC Conjugated | CWBIO | CW0115 | |
| FITC anti-mouse CD3 | Biolegend | 17A2 | |
| APC anti-mouse CD3 | Biolegend | 100236 | |
| PerCP anti-mouse CD8a | Biolegend | 100732 | |
| Percoll | GE Healthcare | P8370 | |
| PMSF | Ameresco | 0754-5G | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
| Streptadivin | BD | S4762-FZ | Gives a clear solution at 10mg/ml in PBS and stored at -20 °C |
| Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | 5 mg in 2.5 ml DMSO, aliquots stored at -20ºC |
| Leupeptin | Sigma | L8511 | 5 mg in 2.5 ml dH 2 O, aliquots stored at – 20ºC |
| Peptides | Scilight-peptide | Must be resuspended in DMSO and stored at -20 °C | |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | Must be stored at 4°C |
| DMSO | MP | 219605590 | Store at room temperature. |
| APC-Streptadivin | BD | 554067 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
| FITC-Streptadivin | BD | 554060 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
| PE-Streptadivin | BD | 554061 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
| BV421-Streptadivin | BD | 563259 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
| PageRuler Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Must be stored at 4°C |
| Cell Strainers | BF | BF10-5040 | Store at room temperature. |
| Amicon Ultra 100kDa | Millipore | UFC510024 | Store at room temperature. |
| Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| FACS Cantol | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | ||
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE healthcare | 28990944 | |
| AKTA PURE | GE healthcare | ||
| red blood cell lysis buffer | Solarbio | R1010 | Store at 4°C. |
References
- Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
- Hazin, A. N., et al. Computed Tomographic Findings in Microcephaly Associated with Zika Virus. The New England Journal of Medicine. 374 (22), 2193-2195 (2016).
- Zhang, Y., et al. Highly diversified Zika viruses imported to China, 2016. Protein & Cell. 7 (6), 461-464 (2016).
- Cauchemez, S., et al. Association between Zika virus and microcephaly in French Polynesia, 2013-15: a retrospective study. The Lancet. 387 (10033), 2125-2132 (2016).
- Turtle, L., et al. Human T cell responses to Japanese encephalitis virus in health and disease. The Journal of Experimental Medicine. 213 (7), 1331-1352 (2016).
- Dudley, D. M., et al. A rhesus macaque model of Asian-lineage Zika virus infection. Nature Communications. 7, 12204 (2016).
- Osuna, C. E., et al. Zika viral dynamics and shedding in rhesus and cynomolgus macaques. Nature Medicine. 22 (12), 1448-1455 (2016).
- Stettler, K., et al. cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science. 353 (6301), 823-826 (2016).
- Zhao, M., Zhang, H., Liu, K., Gao, G. F., Liu, W. J. Human T-cell immunity against the emerging and re-emerging viruses. Science China Life Sciences. 60 (12), 1307-1316 (2017).
- Huang, H., et al. CD8+ T Cell Immune Response in Immunocompetent Mice during Zika Virus Infection. Journal of Virology. 91 (22), 00900-00917 (2017).
- Elong Ngono, A., et al. Mapping and Role of the CD8+ T Cell Response During Primary Zika Virus Infection in Mice. Cell Host & Microbe. 21 (1), 35-46 (2017).
- Marques, E. T. A., Burke, D. S. Tradition and innovation in development of a Zika vaccine. The Lancet. 391 (10120), 516-517 (2017).
- Xu, K., et al. Recombinant Chimpanzee Adenovirus Vaccine AdC7-M/E Protects against Zika Virus Infection and Testis Damage. Journal of Virology. , 01722-01817 (2018).
- Jama, B. P., Morris, G. P. Generation of human alloantigen-specific T cells from peripheral blood. Journal of Visualized Experiments. (93), e52257 (2014).
- Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. Journal of Visualized Experiments. (68), e4420 (2012).
- Govindarajan, S., Elewaut, D., Drennan, M. An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen. Journal of Visualized Experiments. (105), e53256 (2015).
- Posel, C., Moller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain. Journal of Visualized Experiments. (108), e53658 (2016).
- Altman, J. o. h. n. D., et al. Phenotypic Analysis of Antigen-Specific T Lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
- Li, H., Zhou, M., Han, J., Zhu, X., Dong, T., Gao, G. F., Tien, P. Generation of murine CTL by a hepatitis B virus-specific peptide and evaluation of the adjuvant effect of heat shock protein glycoprotein 96 and its terminal fragments. J Immunol. 174 (1), 195-204 (2005).
- Valkenburg, S. A., et al. Preemptive priming readily overcomes structure-based mechanisms of virus escape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5570-5575 (2013).
- Shang, T., et al. Toll-like receptor-initiated testicular innate immune responses in mouse Leydig cells. Endocrinology. 152 (7), 2827-2836 (2011).
- Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), e52293 (2015).
- Zhou, M., et al. Screening and identification of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus-specific CTL epitopes. The Journal of Immunology. 177 (4), 2138-2145 (2006).
- Barzon, L., Lavezzo, E., Palu, G. Zika virus infection in semen: effect on human reproduction. The Lancet Infectious Diseases. 17 (11), 1107-1109 (2017).
- Ma, W., et al. Zika Virus Causes Testis Damage and Leads to Male Infertility in Mice. Cell. 167 (6), 1511-1524 (2016).
- Li, X. F., et al. Characterization of a 2016 Clinical Isolate of Zika Virus in Non-human Primates. EBioMedicine. 12, 170-177 (2016).
